羊栖菜联合姬松茸多糖对胰岛β细胞保护作用*

张 杰，杨旭东**，申梅淑，宋高臣，王桂云， 石 杰，田丽梅，杨骄霞，詹必勋

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011； 3.牡丹江血栓病医院，黑龙江 牡丹江 157011)

〈生理生化〉

羊栖菜联合姬松茸多糖对胰岛β细胞保护作用*

张 杰1，杨旭东1**，申梅淑1，宋高臣1，王桂云1， 石 杰1，田丽梅1，杨骄霞2，詹必勋3

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011； 2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011； 3.牡丹江血栓病医院，黑龙江 牡丹江 157011)

探讨羊栖菜多糖、姬松茸多糖对高糖培养的胰岛β细胞的保护作用及其机制。将胰岛β细胞随机分为5组：正常对照组、模型组、SFPS组、ABP组、两药联合组。应用MTT法检测对胰岛β细胞增殖能力的影响，应用荧光显微镜检测胰岛β细胞凋亡情况，并用RT-PCR法检测bax、caspase-3基因表达量的变化。结果表明，SFPS、ABP能明显减轻高糖对胰岛βTc3细胞的生长抑制，抑制高糖诱导的胰岛β细胞凋亡，并明显降低bax、caspase-3基因表达(p<0.01)，两药联合作用更明显，其作用机制可能与调控bax、caspase-3基因表达有关。

羊栖菜多糖；姬松茸多糖；胰岛细胞；细胞凋亡；βTc3细胞

2型糖尿病是1种复杂的代谢紊乱性疾病，发病机理至今尚未阐明，胰岛素抵抗出现在肥胖患者和少数非肥胖患者身上，但无论是否肥胖都会出现进行性的胰岛β细胞损伤[1]，因此在2型糖尿病研究中，研究胰岛β细胞功能及损伤有重要的意义。羊栖菜多糖(SargassumfusiformePolysaccharide，SFPS)是从海藻羊栖菜中提取的多糖，有研究发现其具有降血糖、治疗糖尿病合并症等作用[2，3]，姬松茸多糖(AgaricusblazeiMurill Polysaccharide，ABP)，为蘑菇科、蘑菇属真菌姬松茸的主要有效成分，具有增强机体免疫力、降血糖等作用[4]。但SFPS 联合ABP是否具有保护高糖培养的胰岛β细胞的作用及其机制，尚未见进一步报道。本实验从细胞及分子水平上，探讨SFPS联合ABP对胰岛β细胞功能的作用及可能的机制，为临床应用SFPS联合ABP治疗糖尿病提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

小鼠βTc3 细胞系，购自北京欣源佳和生物科技有限公司。

1.2 实验药品

RNA提取试剂(Trizol)及四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)，购自美国Sigma公司；荧光染料(Hoechst33258)，购自百浩生物科技有限公司；引物核苷酸片段，购自上海生工生物技术有限公司。

1.3 细胞培养

小鼠βTc3细胞培养于 RPMI-1 640 培养液(100 mL·L-1胎牛血清)，于CO2培养箱中37℃培养，4 d～5 d 培养1代，2 d 换液1次。

1.4 实验分组

取生长良好的βTc3细胞用于实验，实验分为5组。A组(正常对照组)：完全 1640 培养基培养；B组(模型组)：33.3 mmol·L-1葡萄糖的培养液培养；C组(SFPS组)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 500 mg·L-1SFPS培养；D组(ABP组)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 200 mg·L-1ABP培养；E组(SFPS+ABP组)：33.3 mmol·L-1葡萄糖和 500 mg·L-1SFPS+200 mg·L-1ABP培养。各组加药后培养基培养 12 h。

1.5 MTT法测定βTc3细胞增殖抑制率

收集βTc3细胞 200 μL，0.25%胰蛋白酶消化，接种于96孔培养板上，细胞浓度为1×105个·mL-1，每个剂量设12个平行孔，按上述分组处理细胞 12 h 后，除调零组外，其他各组分别加入 5 g·L-1的MTT 20 μL，4 h 后，弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL·孔-1，调节酶标仪 450 nm，测定各孔吸光度值(A)，用RPMI-1 640 培养液调零，检测SFPS对βTc3细胞增殖的影响。按下列公式计算细胞生长抑制率(Inhibition Rate，IR)，公式为：

IR=(A1-A2)(A1-A0)×100%

式中：A1表示对照组吸光度值；A2表示实验组吸光度值；A0表示空白组吸光度值。

1.6 细胞凋亡检测

收集不同组的βTc3细胞，胰酶消化，pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，固定液(甲醇冰醋酸=3∶1)4℃固定 10 min，蒸馏水冲洗3遍。然后用 5 mg·L-1Hoechst 33258 染色，在5%CO2培养箱中37℃染色 15 min，用盖玻片封片后，放置于荧光显微镜下观察。随机选取10个视野计算凋亡率，荧光标记的凋亡细胞呈现蓝色深染。凋亡率(P)公式为：

P=N1[(N1+N2)]×100%

式中：N1表示凋亡细胞数；N2表示正常细胞数。

1.7 RT-PCR测定caspase-3、bax基因的表达

caspase-3上游引物：5’-AGTCTGACTGGAAAGCCGAA-3’；下游引物：5’-CGGGATC TGTTTCTTTGCAT-3’，扩增片段 342 bp。bax上游引物：5’-GACACCTGAGCTGACCTTG G-3’；下游引物：5’-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3’，扩增片段 310 bp。β-actin，上游引物：5’-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3’，下游引物：5’-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3’，扩增片段 838 bp。反应条件：95℃预变性 5 min，94℃反应 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35个循环，72℃复性 10 min。经17%琼脂糖凝胶电泳分离后，凝胶成像系统进行分析，分别计算caspase-3β-actin和baxβ-actin的灰度比值作相对定量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 胰岛βTc3细胞增殖抑制率

药物作用于高糖培养的胰岛βTc3细胞 12 h 后，实验结果见表1。

表1 药物对胰岛βTc3细胞增殖抑制率的影响

注：与模型组比较，*p<0.01。

由表1可见，与模型组比较，药物各组均能减轻高糖对胰岛βTc3细胞的生长抑制作用(p<0.01)，SFPS+ABP组对减轻高糖对胰岛βTc3细胞的生长抑制效果最明显。

2.2 荧光显微镜检测βTc3细胞凋亡情况

药物作用于高糖培养的胰岛βTc3细胞 12 h 后，荧光显微镜检测βTc3细胞凋亡情况见图1、图2。

实验结果显示，培养的各组细胞均可见凋亡细胞，但凋亡率各不相同，与正常对照组凋亡率(3.95%)比较，模型组凋亡率(21.57%)明显升高，说明高糖可以诱导βTc3细胞凋亡；SFPS组凋亡率为13.98%，ABP组凋亡率为12.36%，SFPS+ABP组凋亡率为10.03%，与模型组比较，SFPS+ABP组降低凋亡率效果最明显(p<0.01)。

2.3 各组中caspase-3、bax基因表达情况

在胰岛βTc3细胞中，bax、caspase-3基因mRNA表达的变化情况见表2。

表2 胰岛βTc3细胞中bax、caspase-3基因(mRNA表达变化

注：与正常对照组比较，*p<0.01；与模型组比较，#p<0.01。

凝胶成像系统分析电泳结果显示，与正常对照组比较，模型组caspase-3和bax基因mRNA的表达明显增加(p<0.01)；与模型组比较，不同药物组caspase-3和bax基因mRNA的表达明显减少，SFPS+ABP组降低caspase-3和bax基因mRNA的表达最明显(p<0.01)。

3 讨论

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是1种代谢紊乱性疾病，在人群中的发病率正逐年上升，其中95%为2型糖尿病。以往对2型糖尿病研究主要集中在胰岛素分泌不足及胰岛素抵抗上，但对胰岛β细胞功能异常的作用却被忽视。但胰岛β细胞功能异常在2型糖尿病发生中起着非常重要作用，持续高血糖可诱导并加重β细胞功能损害[5]，继而发生衰竭，最终发展成为2型糖尿病[6，7]，而细胞凋亡和细胞生长抑制是细胞损伤的2种重要方式。

细胞凋亡又称程序性死亡，是由一系列半胱氨酸蛋白酶(caspase)级联反应高度调控的，激活caspase是细胞凋亡的不可抑制步骤[8]，是细胞凋亡的中心环节。目前发现的caspase家族成员有14种，caspase-3是家族中最重要的，通常以酶原的形式存在，在诱导因素的作用下，caspase-3酶原由线粒体释放到细胞质中被激活，活化的caspase-3可以在一些重要的蛋白质的天冬氨酸残基切断肽键，改变其结构，影响信号分子，引起细胞凋亡[9]，所以caspase-3是凋亡反应的最关键的酶即核心酶。bax是bcl-2家族的促凋亡蛋白，在凋亡刺激信号的刺激下，bax的促凋亡作用是以自身形成bax-bax同源二聚体的形式，激活caspase-3活性，导致细胞凋亡[10]。本实验结果发现，SFPS能降低胰岛βTc3的增殖抑制率，降低其细胞凋亡，并增加bax和caspase-3基因的表达。

本实验以高浓度葡萄糖( 33.3 mmol·L-1)体外培养胰岛βTc3细胞，模拟糖毒性诱导βTc3细胞凋亡。结果显示与正常对照组比较，高糖培养的模型组中的βTc3细胞凋亡率明显增高，胰岛βTc3细胞的生长明显受到抑制，说明持续高血糖可诱导βTc3细胞凋亡并加重β细胞功能损害。分别选用SFPS、ABP及SFPS+ABP联合培养胰岛βTc3细胞，结果发现，药物组凋亡率和生长抑制率明显低于高糖培养的模型组，说明SFPS、ABP可以改善高糖诱导的βTc3细胞凋亡和β细胞功能损害，但SFPS+ABP联合作用效果最明显。

综上所述，SFPS+ABP联合能明显降低胰岛βTc3细胞的bax和caspase-3基因的表达，这提示其降低糖毒性引起的胰岛βTc3细胞的生长抑制和细胞凋亡，可能与其调控，bax和caspase-3基因的表达有关。然而，其具体作用机制有待进一步实验研究。

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[2]张信岳，程敏，孟倩超，等.羊栖菜多糖降血脂作用研究[J].中国海洋药物，2003，22(5)：27.

[3]关悦，李扬，刘佳维.羊栖菜多糖对糖尿病脑缺血大鼠细胞凋亡的影响[J].中国海洋药物，2013，32(2)：63-66.

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云南香格里拉新鲜松茸大量出口日本

松茸作为世界上珍稀名贵的天然药用菌，我国主要产茸区有香格里拉产茸区、楚雄产茸区和延边产茸区等地区。松茸含有18种氨基酸等丰富的营养以及不错的口感深受人们的喜爱。而日本人对松茸更是情有独钟，几乎到了“崇拜”的地步。但是日本自产的松茸很少，大部分需要从中国、韩国等地进口。据了解，今年7月份以来，共有38.4 t产于云南香格里拉的松茸通过南航航班从昆明经广州中转至日本大阪，比去年同期增加了75%。一般松茸在保鲜的情况下可以保存7 d～10 d，昆明松茸从采摘到上市日本市场约2 d～3 d时间，较好地保存了松茸的新鲜美味。南 航预计，松茸大量出口将持续到10月份。

中国食用菌商务网

2014.09.02

Protective Effect ofSargassumfusiformePolysaccharide Combined withAgaricusblazeiMurill Polysaccharide on Pancreatic Beta Cells

ZHANG Jie1, YANG Xu-dong1, SHEN Mei-shu1, SONG Gao-chen1, WANG Gui-yun1,SHI Jie1, TIAN Li-mei1, YANG Jiao-xia2, ZHAN Bi-xun3

(1.Mudanjiang Medical College, MudanjiangHeilongjiang157011; 2.Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College, MudanjiangHeilongjiang157011; 3.Mudanjiang Thromboembolism Hospital, MudanjiangHeilongjiang157011)

The protective effect and mechanism of SFPS and ABP on pancreatic beta cells in high glucose were studied. Pancreatic βTc3 cells were randomly divided into model group, SFPS group, ABP group,SFPS+ABP group, and normal control group. The cells proliferation by MTT and cell apoptosis of βTc3 cells by fluorescence microscope were observed. The levels of caspase-3 gene expression in all groups by RT-PCR were detected . SFPS and ABP were inhibiting proliferation inhibition rate of βTc3 cells, and reducing apoptosis of βTc3 cells. SFPS and ABP could effectively decrease the apoptotic rate of βTc3 cells and the level of bax and caspase-3 gene expression. And the effect was more obviously in SFPS+ABP, it could effectively decrease the apoptotic rate of βTc3 cells probably through regulating bax and caspase-3 gene expression.

Sargassumfusiformepolysaccharide;AgaricusblazeiMurill polysaccharide; Pancreatic cell; Apoptosis;βTc3 cells

*项目来源：黑龙江省教育厅科学技术研究项目“羊栖菜多糖对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞保护作用及其机制研究”(12531744)。

张杰(1977-)，女，讲师，主要从事中药的药理与毒理研究。

**通信作者： 杨旭东，副教授。E-mail:xingzhe01mdj@126.com

2014-07-29

S646.9

A

1003-8310(2014)05-0037-03