云南迪庆金江木耳驯化栽培研究*

杨春燕，张朝宾，王兴红

(1.云南开放大学， 云南 昆明 650500；2.云南大学 微生物研究所，云南 昆明 650091)

〈育种与驯化〉

云南迪庆金江木耳驯化栽培研究*

杨春燕1，张朝宾2，王兴红2

(1.云南开放大学， 云南 昆明 650500；2.云南大学 微生物研究所，云南 昆明 650091)

云南省迪庆州香格里拉县金江镇打芝坝村仿野生黑木耳栽培技术极其原始，管理粗放，产量极低，但该种木耳口感细腻，品质极佳，价格高昂。为了提高产量，增加经济效益，研究组对该木耳进行了菌种分离(菌株YUCM510200)、鉴定，以及菌株的耐高温和栽培实验研究。研究结果显示，该木耳耐高温，出耳速度快，耳基致密，耳片为薄片型，菊花状，孕面呈灰黑色，背面有毛。产品外观、口味和仿野生栽培的木耳基本相同，只是在泡发时的香气较弱；生物学效率为每公斤干料产鲜木耳1 300 g，以干品计为100 g。该品种由于耐高温能力强，在热带地区具有推广价值。

金江；黑木耳；栽培

黑木耳具有极高的营养价值和药用价值，在我国有悠久的食用历史。我国是木耳生产大国，占世界黑木耳产量的90%以上。不断发现新的优良木耳品种，适应不同的气候环境，丰富人民群众的选择是发展木耳产业的基础。产于云南香格里拉县金沙江边的金江镇兴隆村打芝坝的野生黑木耳，香气浓郁，品质细腻，深受当地人的欢迎，其种植方法是1种较原始的仿野生栽培方法。在清明时节将3年左右的麻栎树砍倒，或利用一些修剪下来的大树枝桠，在雨水充足的4月、5月搭好架，不对耳木进行砍花和接种，利用孢子的自然传播接种，第2年开始出耳。由于该木耳仅产于打芝坝村民组，产地极为局限，生产方式极其原始，产量极低，价格逐年攀升。目前，每公斤售价已高达1 200元，产品供不应求[1]。

为了更好地满足市场需求，对该木耳进行了菌株分离、鉴定和耐高温实验及人工栽培实验，为产业化栽培奠定基础。现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 样品采集

样品采集地点：云南省迪庆洲香格里拉县金江镇打芝坝村。选择发育良好、朵型正常的耳片，干燥后，带至实验室备用。

1.2 木耳的分子鉴定

1.2.1 总DNA提取

木耳先用自来水清洗干净，再用无菌水冲洗2遍，切取50 mg切碎，放入0.5 mL石英砂的无菌EP管中，用玻璃棒研磨。抽提基因组置于-20℃备用。

1.2.2 总DNA检测

用1×TBE缓冲液制备浓度为0.8%的琼脂糖胶，加入核酸染料Goldview使终浓度为0.5 μg·mL-1，取4 μL的DNA样品和1 μL的LoadingBuffer混合后点样，在5 V·cm-1电压下电泳30 min，紫外灯下检测。

1.2.3 ITS序列的PCR扩增

扩增引物：采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS4和ITS5，作为上下游引物进行序列扩增，引物由捷瑞生物合成，序列为ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’[2]。

PCR扩增体系：将0.5 mL Eppendorf管放置于冰盒上，然后依次加入5 μL 10×PCR Buffer、4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP mix、2 μLForward Primer(10 μmol·L-1)、2 μL Reverse Primer(10 μmol·L-1)、2 μL Template DNA、 0.5 μL Taq DNAase(5 U·μL-1)、34.5 μL ddH2O。

PCR扩增条件为：94℃预变性4 min，然后进入32个循环(94℃变性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s)，循环结束后于72℃延伸10 min，16℃保温。

1.2.4 PCR产物检测

用1×TBE缓冲液制备浓度为1.0%的琼脂糖胶，加入核酸染料Goldview，使终浓度为0.5 μg·mL-1，取4 μL的DNA样品和1 μL的LoadingBuffer混合后点样，在5 V·cm-1电压下电泳20 min，紫外灯下检测。

1.2.5 ITS序列的测定

送华大基因公司进行DNA双向测序。

1.2.6 序列分析

测序数据用Contig Express project软件进行拼接，然后在NCBI数据库中进行BLAST比对。下载相关菌株的ITS序列用Clustalx2.1软件进行多序列比对。通过MEGA3.1软件构建NJ系统进化树，在分支上标记1 000次重复获得的自展检验Bootstrap值，以评估系统发育树的置信度[3]。

1.3 木耳菌丝分离

取耳片完整、状态良好的新鲜木耳，自来水冲洗干净，在超净工作台中，无菌水清洗3次～5次，用无菌滤纸尽量吸取多余水分，75%酒精浸泡消毒1 min，立即取出耳片，用灭过菌的无菌水清洗3次～5次，无菌滤纸吸去多余的水分，撕开耳片，用解剖刀或镊子将上下表皮拨开，用无菌竹签或镊子刮取少量耳肉于PDA培养基上，放置于28℃培养、纯化，获得1株迪庆黑木耳菌株，菌株编号为YUCM510200。

1.4 木耳菌株(YUCM510200)高温生长实验

橡胶木屑煮水配置PDA培养基，取干木屑150 g，加马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉18 g，煮30 min，4层纱布过滤，定容至1 L，调节pH为7.0。灭菌30 min，倒平板备用。

将迪庆黑木耳(YUCM510200)、毛木耳2(YUCM510202)、分离自版纳的皱木耳1(YUCM510203)、褐黄木耳2(YUCM510206)、分离自师宗的褐黄木耳(YUCM510207)和黑木耳(YUCM510072)，于28℃下培养3 d待萌发良好后置于35℃培养。观察统计各菌株的生长情况。

1.5 栽培实验

按以下配方进行出耳实验：栎木枝条粉 83%、麦麸15%、石灰15%、石膏1%，培养料含水量约65%。装袋灭菌1 h后，冷却至室温接种。在25℃下培养至菌丝发满全袋。在袋壁划出十字型口，保持湿度和光照，进行出耳实验。

2 结果和讨论

2.1 迪庆木耳的栽培方式

迪庆木耳的栽培方式及耳木上长出木耳的形态见图1、图2。

图1 搭架培养

图2 耳木上长出木耳的形态

由于该木耳的栽培方式只是简单的将耳木摆放在耳场，不进行人工接种，甚至连树皮都不砍花。完全依靠孢子的自然传播接种，故耳木上其它杂菌较多，大部分耳木上的木耳产量都比较少，只有少数耳木上能看到木耳成簇生长。

由于该木耳的产地极为局限，仅在香格里拉县金江镇打芝坝村民组出现，其它地方生长不出同样品质的木耳，加之产量极低，导致该木耳价格高昂。

2.2 分子鉴定

以ITS为依据构建的NJ树见图3。

由图3可知，迪庆金江木耳和黑木耳聚在一起，结合形态观察，可以认定，该木耳是黑木耳[3]。

2.3 木耳菌丝的鉴定

将在平板上分离纯化的木耳菌丝通过ITS序列扩增，测定其序列(YUCM510200)。结果显示，菌丝的序列仍然和木耳聚在一起(图3)，证明分离到的菌丝就是该木耳品种的菌丝。

菌丝在平板上洁白致密，边缘整齐，生长比较缓慢，具有菌香味。

2.4 分离菌株在35℃条件下耐高温对比

迪庆木耳耐高温与其他菌株的对比及显著性差异分析结果见表1。

从表1可以看出，在35℃条件下，迪庆木耳生长状态最好，说明迪庆黑木耳具有较强的耐高温特性，是高温型品种。这可能是因为，虽然香格里拉地处高原地区，但金江镇打芝坝位于金沙江边，属于南亚热带干热河谷气候，年均气温20.4℃，最冷月平均温度14.2℃[4]。由于原始生境温度较高，该木耳能够耐受较高的环境温度。褐黄木耳(YUCM510206)、皱木耳(YUCM510203)分离自景洪，虽然景洪属热带季风气候，年平均气温21.7℃，最高气温41.1℃。但在35℃的高温下，皱木耳的菌丝生长速度也明显变慢。褐黄木耳(YUCM510207)分离自云南师宗五龙，五龙当地小气候全年平均气温为18℃，属于湿热河谷，在35℃温度下，该菌株生长也较缓慢。菌包上发育木耳的形态及出耳菌包见图4、图5。

表1 迪庆木耳耐高温与其他菌株的对比及显著性差异分析

菌株浓密度生长势平均生长速度∕(cm∕6d)差异显著性(0 05)迪庆黑木耳(YUCM510200)浓密++++6 93a栽培黑木耳(YUCM510072)浓+++4 54b版纳毛木耳(YUCM510202)浓+++1 73c版纳褐黄木耳(YUCM510206)浓++1 13d师宗褐黄木耳(YUCM510207)浓++1 13d版纳皱木耳(YUCM510203)一般++1 05d

图4 菌包上发育木耳的形态

图5 出耳菌包

在迪庆经济技术开发区润达生物技术有限公司进行初步的小试栽培实验，鲜品的生物学效率约为130%，以干品计算，则每公斤培养料能产生100 g干木耳。栽培出来的黑木耳，保持了原生木耳的口味特点，只是在泡发时香气较淡。栽培品种由于生长发育时间短，整个栽培周期只有3个～4个月时间，次生物质积累时间短，和野生、仿野生长达几年的时间相比，是否是发育时间短导致次生物质积累不够多，尚未确定。

3 结论

迪庆金江木耳是1个薄片型、菊花状的木耳，是1个耐高温品种，可以进行人工栽培。人工栽培的木耳品质基本达到了和仿野生栽培所产木耳相同的品质。环境温度过高是多种食用菌产业发展的重要制约因素，本文描述的木耳品种能在极高的环境温度下正常生长、出耳，品质优良，产量也较好，为在高温地区发展木耳产业提供了菌种资源。

[1] 中国新闻网. 香格里拉发现千亩原生态木耳林[EBOL]. (2010-02-02). [2014-3-10]. http:finance.591hx.comarticle2010-02-02000025407s.shtml.

[2]陈剑山，郑服从. ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(13)：3785-3786．

[3]Looney B.P., Birkebak J.M., Matheny P.B.. Systematics of the genusAuriculariawith an emphasis on species from the Southeastern United States[J]. North American Fungi, 2013, 8(6):1-25.

[4]地图在线. 金江镇地图[EBOL].(2012-02-10).[2014-2-18]. http:city.uemap.comjinjiang11.html.

Domestication ofAuriculariaauriculaProduced in Jinjiang Village in Diqing State of Yunnan Province

YANG Chun-yan1, ZHANG Zhao-bin2, WANG Xing-hong2

(1.Yunnan Open University, KunmingYunnan650500; 2.Institute of Microbiology of Yunnan University, KunmingYunnan650091)

Auriculariaauricula, called wood ear in China grown at Jinjiang village in Shangri-La County of Yunnan province, was cultivated extremely simple, extensive management with low yield, which was delicate and was sold in high price. In order to increase production and economic benefits, the colony (strain YUCM510200) was separated from the fruit body and was identified. The test of resistance to high temperature and cultivation experiment were done. The results showed that this strain was high temperature resistant, and the bud of wood ear was fast developed and formed compact. Wood ear piece was thin, and fruit body shape was mum. The inner surface was black, and the outer surface had fine hair. Appearance and taste of theAuriculariaauriculacultivated was same to that of bionics wild cultivation, but weak fragrance was present when ear piece was washed in water. Biological efficiency of per 1 kg dry fresh material can produce fresh 1 300 g or dry 100 g. This variety with the high temperature resistant had the value of popularization in the tropics.

Jinjiang village in Diqing State;Auriculariaauricula; Domestication

*项目来源：国家科技支撑计划“云南天然橡胶产业关键技术研究与集成示范”(2011BAD30B00)；“云南微生物菌种资源标准化整理、共享及利用平台建设”(2009DA002-3)；云南省教育厅科学研究基金项目“产生优质血竭的龙血树品种筛选”(2013C107)。

杨春燕(1969-)，女，副教授，主要从事应用微生物研究。E-mail: ychy933@163.com

2014-07-20

S646.6

A

1003-8310(2014)05-0014-03