内标法和外标法测定氟尼辛葡甲胺注射液含量的比较分析

章安源 冯 涛 陈 玲 李淑花 牛华星 张志民 刘霄飞 刘道中（山东省兽药质量检验所 山东 济南 250022）

内标法和外标法测定氟尼辛葡甲胺注射液含量的比较分析

章安源 冯 涛 陈 玲 李淑花 牛华星 张志民 刘霄飞 刘道中（山东省兽药质量检验所 山东 济南 250022）

比较内标定量法和外标定量法在测定氟尼辛葡甲胺注射液含量的差异。运用高效液相色谱法对样品进行分析，然后分别采用内标法和外标法计算其含量。内标法的准确度和精密度均优于外标法，内标法和外标法之间无显著性差异。高效液相色谱法分析含量，采用内标法和外标法的定量方式获得的结果均能满足检测要求。分析人员可根据实际情况视实验室条件而使用相应的定量方式。

氟尼辛葡甲胺注射液 含量 高效液相色谱法 内标法 外标法

氟尼辛葡甲胺注射液含量能准确定量分析的标准方法是《2010版药典》高效液相色谱法内标定量，虽然内标法是标准的实验方法，但操作过程较复杂，并且还需要使用内标物。为求实验方法简便、快捷、准确，以提高效率，本文采用外标定量法来检测同一规格、10个厂家共计10批的氟尼辛葡甲胺注射液含量，并和内标定量法做出比较，测定结果无显著性差异，在检测大批量的样品时，外标法为工作带来了实效。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

WatersE2695高效液相色谱仪，waters2998紫外检测器；氟尼辛葡甲胺对照品(中国兽药药品监察所，批号H0611111，含量99.9%)。氟尼辛葡甲胺注射液(不同厂家规格相同(5%)10批：批号分别为(2013)2251山东天振药业有限公司、(2013)4486齐鲁动物保健品有限公司、(2013)5230山东鲁抗立科药物化学有限公司、(2013)5824烟台绿叶动物保健品有限公司、(2013)7696山东谊源动物药业有限公司、(2014)0211文登市雨泽银丰动物药业有限公司、(2014)0688齐鲁动物保健品有限公司、(2014)2773潍坊富邦药业有限公司、(2014)2929山东中牧兽药有限公司、(2014)3406文登市雨泽银丰动物药业有限公司)。甲醇(色谱纯)水为三级水，其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters symmetryC18.5μm 4.8×150mmm columon；流动相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)；柱温：25℃；检测波长：254nm；流速：1.0mol/L/min；进样体积：20μl。

1.3 内标法

1.3.1 内标溶液的制备[1]取苯甲酸钠适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含33mg的溶液，作为内标溶液。

1.3.2 校正因子[1]的测定 另取氟尼辛葡甲胺对照品约83mg(约相当于氟尼辛50mg)，精密称定，置50ml量瓶中，加适量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入内标溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水（7∶3）稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，计算校正因子。

1.3.3 供试品溶液制备 精密量取本品适量(约相当于氟尼辛50mg)，置50ml量瓶中，加适量甲醇-水(7∶3)使溶解，精密加入内标溶液5ml，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，测定、计算。

2 结果与讨论

2.1 专属性试验[2]

用内标法分别对10个相同规格的氟尼辛葡甲胺供试品进行测定；按照内标溶液的制备方法，取内标溶液苯甲酸钠10μl加入供试品中，内标溶液出峰快，见图1.内标峰和氟尼辛葡甲胺注射液对照品、供试品完全分离。见图2，图3。

图1 苯甲酸钠内标

图2 内标法-氟尼辛葡甲胺对照品

图3 内标法-供试品(4486齐鲁动物保健品有限公司)

2.2 外标法

2.2.1 对照品溶液 取对照品50mg，置50ml量瓶中，加适量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4。

2.2.2 供试品溶液 约相当于氟尼辛50mg，置50ml量瓶中，加适量甲醇-水(7∶3)使溶解，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，用甲醇-水(7∶3)稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5。

图4 外标法-氟尼辛葡甲胺对照品

图5 外标法-供试品(4486齐鲁动物保健品有限公司)

2.3 线性关系分析

精密称取氟尼辛葡甲胺对照品适量，分别制成浓度为0.5、1、2、4、20、40、80µg/ml的溶液，按照外标含量测定项下的方法进行测定，取以上7个浓度对照品5μl注入液相色谱仪，平行进样各两次，以两次峰面积平均值为纵坐标，以浓度C(µg/ml)为横坐标(见图5），并进行统计学处理，得到氟尼辛葡甲胺对照品的回归方程为y=0.0245x-0.0056 (R2=0.9996，n=7)，线性范围为0.5～80µg/ml。表明线性良好。

2.4 精密度

取对照品溶液在上述色谱条件下，重复进样6次，每次1μl，峰面积的RSD为0.3%。

2.5 重复性

取同一供试品(4486齐鲁动物保健品有限公司)约1g，精密称定，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，测定，结果平均含量为99.2%，RSD为1%，重复性好。

图5 氟尼辛葡甲胺对照品标准曲线

2.6 稳定性

取同一份供试品溶液，间隔0,1,2,4,6,8,10h分别记录，记录峰面积，结果RSD为3%，表明被测溶液在10h内基本稳定。

2.7 含量结果

2.7.1 内标法、外标法含量 参照《中国兽药典2010》二部对氟尼辛葡甲胺注射液含量测定方法(内标法)及外标法对收集的样品进行含量测定，每个供试品进样6次。含量结果见表1。

表1 内标法与外标法测定氟尼辛葡甲胺甲胺注射液含量 (%)

内标法和外标法的相对偏差无规律，相对偏差集中在0.27%～1.84%之间，偏差幅度不一致，表明内标法与外标法之间不可能存在系统误差。

2.7.2 精密度和准确度的比较 对内标法和外标法测得的氟尼辛葡甲胺含量数据进行统计分析，相对标准偏差(RSD)和准确度等数据列于表2.内标法和外标法测得的10个样品含量水平的RSD和相对误差均小于5%，满足检测工作需要。但内标法的RSD显然小于外标法的RSD，即精密度方面内标法优于外标法；准确度方面，内标法也要优于外标法。

2.7.3 显著性差异分析 对内标法和外标法测得的氟尼辛葡甲胺注射液含量数据进行t检验分析，以判断两者之间是否存在显著性差异[3]，结果见表2。显然，内标法和外标法测得的10组数据之间无显著差异(P＞0.05)。

3 结论

3.1 外标法的优缺点 外标法操作简便，十分合适大量样品分析。但进样量要求十分准确，要严格控制在与对照品相同的操作条件下进行，分析误差易人为造成，经常得不到准确的测量结果。每次样品分析的相同的操作条件下进行很难完全相同，如流动相的配制、室温、检测器的响应性能等，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

表2 内标法与外标法测定氟尼辛葡甲胺注射液含量结果统计分析(%)

3.2 内标法的优缺点 测定的结果较为准确，由于通过测量内标物(即校正因子)及欲测组分的峰面积的相对值来进行计算，因而在一定程度上消除了操作条件(如进样量的变化、色谱条件的微小变化)等的变化所引起的误差，别是在样品前处理前加入内标物，然后再进行前处理，可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。内标法结果的精密度和准确度均较好，但操作较为麻烦。

内标与外标都是定量的一种方法，应用内标法和外标法分析氟尼辛葡甲胺注射液的含量结果，本试验两者之间也不存在显著性差异(P＞0.05)。本试验内外标法的准确度、精密度均满足检测工作需要(RSD＞0.05)，至于哪一种方法好不能一概而论，应根据不同的分析要求，以及实验室的条件(如有无自动进样设备、有无所需的试剂)等情况来决定。应用外标法如果能够满足要求，可以优先考虑外标法，简单而省事，进样体积的重现性很好，不用内标也具很好的分析精度，加入内标反而对分析不利[4]。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的条件下，用内标法还是必要的。无论应用那种定量方法，都应做好方法的验证和确认工作，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都可以应用[5]。

[1] 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典2010版2部[S].

[2] 邱净英, 梁光义, 蒋品等. 高效毛细管电泳内标法与外标法含量测定的比较[J]. 光谱实验室, 2012, 29(5)∶ 2616-2621.

[3] 徐静, 黄建军. 气相色谱检测白酒中乙酸乙酯内标法和外标法的比较研究[J]. 柳州职业技术学院学报, 2006, 6(4)∶ 61-63.

[4] 涂新军, 谭奥, 徐明辉. 内标法在液相色谱应用中的局限性[J]. 中国药事, 1998, 12(6)∶ 387-388.

[5] 黄诚, 卢丽明, 刘国平. 内标法和外标法测定血液中乙醇含量的比较分析[J]. 生命科学仪器, 2008,6(3)∶ 41-43.

S859.7

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1007-1733(2014)11-0003-03

2014–08–12）