核桃青皮多糖超声辅助提取工艺及抗氧化活性研究

吕建平　张直峰　聂倩　闫桂琴

摘要：以多糖得率为指标，水料比、提取时间、提取温度为考察因素，在单因素试验的基础上，采用响应面法对核桃（Juglans regia L.）青皮多糖超声辅助提取工艺进行优化，并对核桃青皮多糖清除羟基自由基和超氧阴离子自由基活性进行了分析。结果表明，核桃青皮多糖超声辅助提取最佳工艺条件为：水料比18∶1（V∶m）、提取时间31 min、提取温度80 ℃、提取2次，在此条件下多糖得率为9.02%；核桃青皮多糖对羟基自由基及超氧阴离子自由基均有一定的清除活性，但其清除作用小于维生素C。

关键词：核桃（Juglans regia L.）青皮；多糖；超声辅助提取；响应面法；抗氧化活性

中图分类号：S664.1；O629.12 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-1148-05

多糖（Polysaccharide）是指聚合度超过10以上的多聚糖，是广泛存在于动物、植物及微生物中的一类大分子化合物，具有许多重要的生物活性，如参与细胞骨架的构成，同时它也是多种内源性生物活性分子的组成成分[1]。研究发现，多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗感染、降血糖血脂、治疗艾滋病等功效[2]，其免疫调节作用是主要作用，所以又叫免疫活性多糖[3]。目前，多糖已经成为当今医药研究领域的重要组成部分。核桃（Juglans regia L.）是我国重要的经济林树种之一[4]，我国核桃栽培面积及产量均居世界首位。核桃富含蛋白质、维生素、亚油酸等[5]。在食用和生产过程中，核桃利用部位主要为其种仁，大量的青皮被废弃，但现有研究显示核桃青皮中也富含许多生物活性成分[6]。因此，如能从核桃青皮中提取具有免疫活性的多糖，可实现资源化利用。本研究对核桃青皮多糖的超声辅助提取工艺进行优化，并对其体外抗氧化活性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

材料：核桃青皮2012年购于山西古县，清洗干燥后粉碎，过60～80目筛，备用。

试剂：AB-8大孔吸附树脂、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、邻苯三酚、抗坏血酸，所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 参照刘岿等[7]的方法进行多糖的提取，核桃青皮样品经石油醚回流脱脂后，加入一定体积的蒸馏水（水料比为5∶1～25∶1，V∶m），水浴（50～90 ℃）超声提取（10～90 min），提取2次，过滤后合并滤液减压浓缩，用Sevag法除去蛋白质，3倍体积95%的乙醇沉淀多糖，真空干燥沉淀，即得到核桃青皮粗多糖。

1.2.2 多糖含量的测定 采用蒽酮-硫酸法测定多糖的含量[8]，以葡萄糖作为标准品，采用紫外可见分光光度法在625 nm波长下测定吸光度，以吸光度值（Y）为纵坐标，葡萄糖浓度（X）为横坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线，得到方程为Y=3.48X+0.000 8，R2=0.999 6。核桃青皮多糖得率为：

R= m1/m2×100%

式中m1为粗多糖中多糖质量；m2为原料干重。1.2.3 超声辅助提取核桃青皮多糖最佳条件的确定 根据水料比、提取时间、提取温度3个单因素试验所确定的水平范围，应用Design-Expert 7.0软件，根据Central-Composite中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面试验，利用响应面试验结果，确定核桃青皮多糖的最佳提取条件，试验具体因素与水平见表1。

1.2.4 核桃青皮粗多糖的精制 参照仰榴青等[9]、朱建飞等[10]的方法，准确称取按照“1.2.1”中方法制备的核桃青皮粗多糖400 mg，溶于200 mL蒸馏水中，过AB-8大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗脱200 mL，流速1 mL/min。将纯化后的多糖溶液浓缩干燥至恒重，用于抗氧化活性的分析。

1.2.5 核桃青皮多糖抗氧化活性的测定

1）清除羟基自由基活性的测定

采用水杨酸法[11，12]测定羟基自由基的清除率。在10 mL比色管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL和不同浓度的多糖或维生素C溶液2 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL。充分混匀后于37 ℃水浴30 min，于波长510 nm处测定吸光度，以加蒸馏水为空白对照，用以下公式计算羟基自由基的清除率：

R=[（Ao-Ai）/Ao]×100%

式中，Ao表示空白对照的吸光度；Ai表示加入抗氧化剂体系的吸光度。

2）清除超氧阴离子活性的测定

采用邻苯三酚自氧化法[13]测定超氧阴离子的清除率。将50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）的缓冲液4.5 mL置于25 ℃水浴中预热25 min，依次加入不同浓度的多糖或维生素C溶液各1 mL，2.5 mmol/L 邻苯三酚溶液0.4 mL。混匀后，在4 min内于波长325 nm处每隔30 s测定溶液的吸光度，计算邻苯三酚溶液的吸光度随时间的变化率K，以蒸馏水为空白对照，用以下公式计算超氧阴离子的清除率：

R=[（Ko-Ki）/Ko]×100%

式中，Ko表示加入蒸馏水空白对照的邻苯三酚溶液的吸光度随时间的变化率；Ki表示加入抗氧化剂体系的邻苯三酚溶液的吸光度随时间的变化率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 水料比对核桃青皮多糖得率的影响 选择

5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的水料比，60 ℃超声提取30 min，结果见图1。由图1可知，随着水料比的增加，多糖得率先增大后减小。当水料比为15∶1时，多糖得率达到最大。这可能是由于随着提取体积的增加，后续浓缩、醇沉工艺的操作增多，损失了多糖。因此，水料比范围选择10∶1～20∶1为宜。

2.1.2 提取时间对核桃青皮多糖得率的影响 选择水料比为15∶1，60 ℃超声提取10、30、50、70、90 min，结果见图2。由图2可知，随着提取时间的延长，多糖得率先增加后减小，30 min时达到最大。这可能是由于超声波可以加速细胞内的多糖释放到提取液中，前30 min破碎细胞中的大部分多糖释放出来，多糖得率增加。但继续延长提取时间多糖降解，多糖得率反而减小。因此，提取时间范围选择10～50 min为宜。

2.1.3 提取温度对核桃青皮多糖得率的影响 选择水料比为15∶1，在50、60、70、80、90 ℃条件下超声提取30 min，结果见图3。由图3可知，随着提取温度的增加，多糖得率迅速增大，当温度达到70 ℃后，多糖得率基本保持不变。因此，提取温度范围选择60～80 ℃为宜。

2.1.4 提取次数对核桃青皮多糖提取率的影响 选择水料比为15∶1，70 ℃超声提取30 min，在此条件下提取1、2、3、4、5次，结果见图4。由图4可知，提取2次以后，随着提取次数的增加，多糖得率增加缓慢。因此，选择提取2次为宜。

2.2 响应面分析结果

根据单因素试验结果，确定提取次数为2次，以水料比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）为自变量，以核桃青皮多糖得率为响应值（R），进行响应面分析试验，结果见表2。利用Design-Expert 7.0软件进行试验结果的数据分析，根据试验结果建立的数学模型为R=8.254 91+0.539 00A+0.130 00B+1.237 00C+0.066 250AB+0.311 25AC-0.126 25BC-0.702 27A2-0.317 27B2-0.662 27C2。根据响应面二次模型进行变异分析（Analysis of variance，ANOVA），结果见表3。从表3的分析结果来看，整体模型的P<0.000 1，表明该二次方程模型极显著。水料比和提取温度对多糖得率的影响达极显著水平，提取时间对多糖得率的影响达显著水平。在本试验条件下，3个因素对多糖得率影响的大小程度为提取温度、水料比、提取时间。除了二次项AB不显著外，其他二次项都显著。方程的失拟项不显著，表明该方程对试验拟合情况好，试验误差小。

模型R2=0.993 9，说明自变量与响应值之间线性关系显著。R2Adj=0.988 5和R2Pred=0.932 3，表明试验预测值和实际值基本相符。CV值为1.82%，表明试验误差小。以上结果表明，此回归模型拟合程度良好，满足试验分析的要求。

各因素之间对多糖得率的交互影响见图5-7。从图5可以看出，提取温度一定时，水料比和提取时间的交互作用对多糖得率的影响不显著。在图6中，响应面曲线最为陡峭，表明提取时间一定时，水料比和提取温度的交互作用对多糖得率的影响极显著。从图7可以看出，当水料比一定时，提取时间和提取温度的交互作用对多糖得率的影响显著。比较3个响应面曲线可知，提取温度对多糖得率的影响最大，水料比次之，提取时间相对影响最小。这与ANOVA分析结果相一致。

2.3 模型的验证性试验

通过Design-Expert 7.0软件分析得到核桃青皮多糖超声提取优化后的条件为水料比18.05∶1，提取时间31.4 min，提取温度80 ℃。在此条件下提取2次，预计多糖得率为9.09%。为了检验模型的准确性，考虑到实际操作中的可行性，修正提取条件为水料比18∶1，提取时间31 min，提取温度为80 ℃。在此条件下提取2次，进行3次平行试验，实际测得的多糖平均得率为9.02%，模型预测值为9.09%，预测值与实际值相差较小，证明该模型得出的核桃青皮多糖提取的参数是可行的。

2.4 核桃青皮多糖的抗氧化能力

2.4.1 对羟基自由基清除能力的测定 核桃青皮多糖及维生素C对羟基自由基的清除作用见图8。可以看出，核桃青皮多糖对羟基自由基有很明显的清除作用，且随着核桃青皮多糖和维生素C浓度的增加，清除率逐渐增加。在相同浓度下，其核桃青皮多糖对羟基自由基的清除率小于维生素C。

2.4.2 对超氧阴离子清除能力的测定 核桃青皮多糖和维生素C对超氧阴离子的清除作用见图9。由图9可知，随着核桃青皮多糖和维生素C浓度的增加，核桃青皮多糖和维生素C对超氧阴离子的清除率增加，相同浓度下，维生素C对超氧阴离子的清除率高于核桃青皮多糖。

3 小结与讨论

随着植物次生代谢产物研究的发展，超声波由于其独特的机械效应、热学效应及空化效应[14]已经应用到植物有效成分的提取中，特别在植物多糖的提取中已显示出明显的优势。本试验采用超声辅助提取工艺，获得较好的效果。通过响应面法分析获得的核桃青皮多糖超声辅助提取的最佳工艺条件为水料比18∶1，提取时间31 min，提取温度80 ℃；提取2次时，核桃青皮多糖得率达到9.02%。与于翠莲[15]研究的核桃青皮多糖热水浸提工艺技术相比，具有提取时间短、多糖得率高的优点。

羟基自由基是生物体内毒性较大的自由基[16]。超氧阴离子自由基的毒性是机体发生氧中毒的主要原因[13]。植物多糖作为一种无毒副作用的天然提取物，已有大量研究表明其具有一定的抗氧化作用。李利华[17]、Wang等[18]对百合、人参多糖抗氧化活性进行报道。本研究体外抗氧化活性结果表明，在本试验条件下，核桃青皮多糖对羟基自由基的清除率和对超氧阴离子自由基的清除率不及维生素C，但核桃青皮多糖对羟基自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，因此，可作为一种潜在的天然抗氧化剂运用在医药学中。

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