越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性研究

2014-07-05 04:08王贻莲郭凯陈凯李纪顺杨合同
湖北农业科学 2014年5期
关键词:伯克霍尔德氏菌

王贻莲 郭凯 陈凯 李纪顺 杨合同

摘要:研究越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418产生的杀线虫活性代谢产物,采用根结线虫(Meloidogyne spp.)2龄幼虫生物测定法对B418发酵液上清液的热稳定性、酸碱稳定性及有机溶剂的稳定性进行了研究。结果表明,B418代谢产物的处理温度最高不应超过60 ℃;pH稳定范围为7.0~10.0,其中pH为7.0时B418代谢产物活性最高,B418代谢产物处理后8 h试虫最高校正致死率为76.63%;以乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇均降低了B418代谢产物的杀线虫活性,氯仿不影响代谢产物活性,氯仿处理后的代谢产物线虫死亡率稳定在74%以上。

关键词:越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418;代谢产物;杀线虫活性;稳定性

中图分类号:TQ453.5;S432.4+5 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)05-1066-03

植物寄生线虫是一类重要的植物病原物,其危害超过细菌和病毒,仅次于致病真菌 [1,2]。据估计,全球每年由植物寄生线虫造成的损失达1 250亿美元[2],这一损失的70%是由根结线虫(Meloidogyne spp.)引起[3]。根结线虫寄主范围广,可危害多种常见蔬菜,且以种植面积较大的番茄、黄瓜、芹菜等受害较重,已成为蔬菜生产中的严重问题之一[4]。

保护地蔬菜根结线虫的治理非常困难,在实际生产中,传统的耕作措施,如轮作、种植抗病品种、施用农家肥、日晒等往往难以奏效。长期大量施用化学杀线虫剂防治根结线虫,会导致农产品农药残留超标和环境污染,破坏生态平衡[5]。生物防治因具有除害增产、保护生态平衡、减轻环境污染等优势[6],越来越受到人们的关注。

多功能生防菌越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418由山东省科学院生物中心农业微生物研究室保存,该菌分离自白俄罗斯大麦根际土壤,能够有效防治根结线虫病。田间试验表明[7,8],B418对番茄根结线虫病的防治效果为63.42%,对茄子根结线虫的防治效果为75.60%。室内毒力测定结果显示, B418发酵液上清液处理2龄根结线虫6 h后校正死亡率达70%以上,可见,B418代谢产物含有杀线虫活性物质。本研究对越南伯克霍尔德氏菌B418发酵液上清液的热稳定性、酸碱稳定性及有机溶剂的稳定性进行了检测,旨在为其杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

越南伯克霍尔德氏菌B418、南方根结线虫(Meloidogyne incongnita),由山东省科学院生物中心农业微生物研究室保存;乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和盐酸均为市售分析纯。

B418 固体培养基每升含 K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.02 g、CaCl2 0.2 g、NaMoO4·2H2O 0.002 g、乙二胺四乙酸铁钠盐0.066 g、谷氨酸钠0.05 g、葡萄糖5 g、琼脂15 g,pH 7.2~7.4;B418 液体培养基每升含蛋白胨10 g、酵母浸出物1 g、CaCl2 0.2 g,pH 7.2~7.4。

1.2 方法

1.2.1 生物测定方法

1)根结线虫2龄幼虫的获得。根结线虫用室内盆栽番茄(中蔬4号)保存。当番茄根系有大量卵囊出现时,取出根系,用自来水轻轻冲洗,小心取下卵囊,0.5% 次氯酸钠中浸泡3 min,无菌水冲洗3次,放在盛有少量无菌水的培养皿里,25 ℃恒温箱中培养4 d,每隔24 h收集1次2龄幼虫。

2)B418发酵上清液活性测定。B418发酵上清液(原液)加入24孔培养板中,每孔加入0.1 mL,5次重复,并设无菌水作对照(CK)。分别向各孔中加入根结线虫2龄幼虫,每孔50条左右。放入25 ℃培养箱中,观察记录线虫死亡情况,计算(校正)死亡率。

1.2.2 B418杀线虫活性产物的稳定性测定

1)不同温度及酸碱度下的稳定性。取B418发酵上清液5倍稀释后分别在常温、60、80、100 ℃ 水浴锅中处理60 min,-20 ℃处理12 h,115 ℃ 处理30 min,测定处理后的B418发酵上清液的杀线虫活性,以6 h校正死亡率来体现。用1 mol /L NaOH 和1 mol /L HCl 将pH 分别调至2.0、3.0、4.0、5. 0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,静置12 h 后将pH 调到7. 0,取原液和处理后的发酵上清液分别5倍稀释后测定杀线虫活性,以8 h校正死亡率来体现。

2)不同有机溶剂下的稳定性。取B418发酵上清液,分别加入等体积乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿和乙酸乙酯,原液混合摇匀静置12 h,如分层则将上下层各取400 μL、不分层的取800 μL,另取原液400 μL滴加到滤纸片上,60 ℃ 烘干,加入与滴加量等体积的无菌水浸泡滤纸片2 h,取浸泡液和原液测定。

2 结果与分析

2.1 B418代谢产物的热稳定性测定

B418代谢产物的热稳定性测定结果见表1。由表1可知, 经60 、80、100、115 ℃热处理后,B418发酵上清液的杀线虫活性随处理温度的升高而下降。表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。

2.2 B418代谢产物的酸碱稳定性

B418代谢产物酸碱稳定性测定结果见表2。由表2可知,B418代谢产物的杀线虫活性稳定的pH范围为7.0~10.0。其中,pH为7.0时活性最强,线虫校正死亡率最高为76.63%。表明B418杀线虫活性产物能耐pH 10.0以下的碱性环境。

2.3 B418代谢产物的有机溶剂稳定性

B418代谢产物的有机溶剂稳定性检测结果见表3。由表3可知,B418代谢产物经有机溶剂处理后,除氯仿和乙醚处理外,杀线虫活性均有较大程度降低,其中乙酸乙酯处理活性降低最多,其上依次为石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿处理原液、原液、60 ℃烘干原液杀线虫活性相当。表明氯仿处理对B418代谢产物的杀线虫活性影响不大。

3 小结与讨论

越南伯克霍尔德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解钾、固氮、促生及防治根结线虫病的作用。但B418菌株作为活菌制剂直接施于田间防治根结线虫病时,其定殖受环境(如土壤有机质、水分、pH、温度、微生物区系)的影响[9,10],制约着B418菌株的使用效果。因此,本试验对越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性进行了研究,旨在为杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础,为新的生物农药开发提供理论依据。

通过对B418菌株发酵上清液稳定性测定,表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。代谢产物杀线虫活性稳定的pH范围为7.0~10.0,pH为7.0时活性最高,8 h最高校正死亡率为76.63%。另外,在测定B418代谢产物生长曲线及pH变化中发现,初始pH为7.4时,接菌后前6 h发酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持续上升,6 d时pH达到9.3。由此可知,在分离纯化B418代谢产物时,可不考虑其发酵上清液pH的影响。B418代谢产物的有机溶剂稳定性测定结果表明,氯仿处理不影响活性成分的杀线虫作用;乙醚处理杀线虫活性虽然最高,因其有易挥发特性,可能存在溶剂相减少,样品浓缩的可能,故试验结果有待进一步证实。

参考文献

[1] 韩生成,刘清利,孟颂东,等.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究进展[J].农业生物技术学报,1999,7(4):395-400.

[2] 陈儒钢.番茄和辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定[D].武汉:华中农业大学,2006.

[3] 莫明和,牟贵平.利用食线虫真菌防治植物寄生线虫的研究进

展[J].大理学院学报,2009, 18(12):71-76.

[4] 赵 磊,段玉玺,白春明,等.辽宁省保护地蔬菜根结线虫发生规律及防治对策[J].植物保护, 2011,37(1):105-109.

[5] 时立波,王振华,刘 静,等.几种杀线剂对土壤微生物数量及真菌多样性影响[J].农药,2008,47(12):917-919.

[6] 雷敬超,黄惠琴.南方根结线虫生物防治研究进展[J].中国生物防治,2007,23(增刊):76-81.

[7] 李纪顺,陈 凯,杨合同,等.伯克霍尔德氏菌B418的生物学特性[A].杨怀文.中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C].北京:中国农业科学技术出版社,2004.

[8] 李善梅,李纪顺,徐维生,等.生防菌剂YKT41及B418防治茄子根结线虫病的田间试验[J].山东科学,2011,24(5):10-13.

[9] 张炳欣,张 平,陈晓斌.影响引入微生物根部定殖的因素[J].应用生态学报,2000,11(6):951-953.

[10] 年洪娟,陈丽梅.土壤有益细菌在植物根际竞争定殖的影响因素[J].生态学杂志,2010,29(6):1235-1239.

2.3 B418代谢产物的有机溶剂稳定性

B418代谢产物的有机溶剂稳定性检测结果见表3。由表3可知,B418代谢产物经有机溶剂处理后,除氯仿和乙醚处理外,杀线虫活性均有较大程度降低,其中乙酸乙酯处理活性降低最多,其上依次为石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿处理原液、原液、60 ℃烘干原液杀线虫活性相当。表明氯仿处理对B418代谢产物的杀线虫活性影响不大。

3 小结与讨论

越南伯克霍尔德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解钾、固氮、促生及防治根结线虫病的作用。但B418菌株作为活菌制剂直接施于田间防治根结线虫病时,其定殖受环境(如土壤有机质、水分、pH、温度、微生物区系)的影响[9,10],制约着B418菌株的使用效果。因此,本试验对越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性进行了研究,旨在为杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础,为新的生物农药开发提供理论依据。

通过对B418菌株发酵上清液稳定性测定,表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。代谢产物杀线虫活性稳定的pH范围为7.0~10.0,pH为7.0时活性最高,8 h最高校正死亡率为76.63%。另外,在测定B418代谢产物生长曲线及pH变化中发现,初始pH为7.4时,接菌后前6 h发酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持续上升,6 d时pH达到9.3。由此可知,在分离纯化B418代谢产物时,可不考虑其发酵上清液pH的影响。B418代谢产物的有机溶剂稳定性测定结果表明,氯仿处理不影响活性成分的杀线虫作用;乙醚处理杀线虫活性虽然最高,因其有易挥发特性,可能存在溶剂相减少,样品浓缩的可能,故试验结果有待进一步证实。

参考文献

[1] 韩生成,刘清利,孟颂东,等.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究进展[J].农业生物技术学报,1999,7(4):395-400.

[2] 陈儒钢.番茄和辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定[D].武汉:华中农业大学,2006.

[3] 莫明和,牟贵平.利用食线虫真菌防治植物寄生线虫的研究进

展[J].大理学院学报,2009, 18(12):71-76.

[4] 赵 磊,段玉玺,白春明,等.辽宁省保护地蔬菜根结线虫发生规律及防治对策[J].植物保护, 2011,37(1):105-109.

[5] 时立波,王振华,刘 静,等.几种杀线剂对土壤微生物数量及真菌多样性影响[J].农药,2008,47(12):917-919.

[6] 雷敬超,黄惠琴.南方根结线虫生物防治研究进展[J].中国生物防治,2007,23(增刊):76-81.

[7] 李纪顺,陈 凯,杨合同,等.伯克霍尔德氏菌B418的生物学特性[A].杨怀文.中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C].北京:中国农业科学技术出版社,2004.

[8] 李善梅,李纪顺,徐维生,等.生防菌剂YKT41及B418防治茄子根结线虫病的田间试验[J].山东科学,2011,24(5):10-13.

[9] 张炳欣,张 平,陈晓斌.影响引入微生物根部定殖的因素[J].应用生态学报,2000,11(6):951-953.

[10] 年洪娟,陈丽梅.土壤有益细菌在植物根际竞争定殖的影响因素[J].生态学杂志,2010,29(6):1235-1239.

2.3 B418代谢产物的有机溶剂稳定性

B418代谢产物的有机溶剂稳定性检测结果见表3。由表3可知,B418代谢产物经有机溶剂处理后,除氯仿和乙醚处理外,杀线虫活性均有较大程度降低,其中乙酸乙酯处理活性降低最多,其上依次为石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿处理原液、原液、60 ℃烘干原液杀线虫活性相当。表明氯仿处理对B418代谢产物的杀线虫活性影响不大。

3 小结与讨论

越南伯克霍尔德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解钾、固氮、促生及防治根结线虫病的作用。但B418菌株作为活菌制剂直接施于田间防治根结线虫病时,其定殖受环境(如土壤有机质、水分、pH、温度、微生物区系)的影响[9,10],制约着B418菌株的使用效果。因此,本试验对越南伯克霍尔德氏菌B418杀线虫活性产物的稳定性进行了研究,旨在为杀线虫活性物质的分离纯化奠定基础,为新的生物农药开发提供理论依据。

通过对B418菌株发酵上清液稳定性测定,表明活性物质的处理温度最高不应超过60 ℃。代谢产物杀线虫活性稳定的pH范围为7.0~10.0,pH为7.0时活性最高,8 h最高校正死亡率为76.63%。另外,在测定B418代谢产物生长曲线及pH变化中发现,初始pH为7.4时,接菌后前6 h发酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持续上升,6 d时pH达到9.3。由此可知,在分离纯化B418代谢产物时,可不考虑其发酵上清液pH的影响。B418代谢产物的有机溶剂稳定性测定结果表明,氯仿处理不影响活性成分的杀线虫作用;乙醚处理杀线虫活性虽然最高,因其有易挥发特性,可能存在溶剂相减少,样品浓缩的可能,故试验结果有待进一步证实。

参考文献

[1] 韩生成,刘清利,孟颂东,等.植物寄生线虫分子生物学和抗线虫基因工程策略的研究进展[J].农业生物技术学报,1999,7(4):395-400.

[2] 陈儒钢.番茄和辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定[D].武汉:华中农业大学,2006.

[3] 莫明和,牟贵平.利用食线虫真菌防治植物寄生线虫的研究进

展[J].大理学院学报,2009, 18(12):71-76.

[4] 赵 磊,段玉玺,白春明,等.辽宁省保护地蔬菜根结线虫发生规律及防治对策[J].植物保护, 2011,37(1):105-109.

[5] 时立波,王振华,刘 静,等.几种杀线剂对土壤微生物数量及真菌多样性影响[J].农药,2008,47(12):917-919.

[6] 雷敬超,黄惠琴.南方根结线虫生物防治研究进展[J].中国生物防治,2007,23(增刊):76-81.

[7] 李纪顺,陈 凯,杨合同,等.伯克霍尔德氏菌B418的生物学特性[A].杨怀文.中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C].北京:中国农业科学技术出版社,2004.

[8] 李善梅,李纪顺,徐维生,等.生防菌剂YKT41及B418防治茄子根结线虫病的田间试验[J].山东科学,2011,24(5):10-13.

[9] 张炳欣,张 平,陈晓斌.影响引入微生物根部定殖的因素[J].应用生态学报,2000,11(6):951-953.

[10] 年洪娟,陈丽梅.土壤有益细菌在植物根际竞争定殖的影响因素[J].生态学杂志,2010,29(6):1235-1239.

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