含自体富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨大面积缺损的实验研究

胡德新 朱 博 应小樟 石仕元 浙江省中西医结合医院骨科 杭州 310003

含自体富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨大面积缺损的实验研究

胡德新 朱 博 应小樟 石仕元 浙江省中西医结合医院骨科 杭州 310003

目的探讨含自体富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨大面积缺损的生物学特性和效果。方法30只新西兰大白兔用利刀切除股骨髁全层关节软骨达关节软骨表面积的20%以上，制成关节软骨大面积缺损模型。实验组30条膝关节取含自体富集骨髓干细胞松质骨移植修复关节软骨缺损；对照组30条膝关节软骨缺损不作任何处理。于术后4、8、12周分批处死动物取材，分别进行膝关节活动度测定、大体观察、光镜观察，并对观察指标进行统计学分析。结果各观察节点实验组兔膝关节活动度均优于对照组（P＜0.01），于术后12周膝关节活动度已基本接近正常。实验组兔膝关节再生软骨的表面积已基本完全填充造模缺损区，而对照组造模区缺损依然严重，仅修复20%左右，两组差异有统计学意义（P＜0.01）；实验组再生软骨与周边软骨愈合良好，再生软骨的厚度为周边正常软骨的三分之二左右，表面较光滑平整，无凹陷。电镜下，造模缺损区被再生软骨组织覆盖，表面光滑平整，周围和正常软骨组织接合较好，基质染色变深，软骨细胞数量增多，且大多为透明软骨细胞，可见潮线。结论含自体富集骨髓干细胞松质骨移植能以类透明软骨形式修复兔关节软骨的大面积缺损。

兔；软骨；松质骨；移植；骨髓干细胞

关节软骨是一种乏血管组织，一旦损伤后其自我修复能力有限。近年来，自体骨软骨镶嵌移植在国内外相继开展，并取得一定的临床疗效[1-2]。然而，该方法的供体资源相当缺乏，使得该技术在临床应用上存在瓶颈。解决供体资源的来源，成为关节外科医生的重大挑战。本实验使用含自体富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植修复兔关节软骨大面积缺损，并通过大体、电镜等观察，以期为临床修复大面积关节软骨缺损提供有效的供体来源。

1 材料与方法

1.1动 物 健康成年纯种新西兰大白兔30只，雌雄不限，体质量3.0～4.5kg，由浙江中医药大学提供，实验动物使用合格证号：SYXK（浙）2008-0116。饲养环境温度18～22℃。

1.2方 法

1.2.1分 组 实验动物共60条膝，以计算器产生的随机数字制作成随机数字表，从随机数字表任意点开始选取连续的数字随机分为实验组和对照组，每组30条膝关节。手术前观察所有动物活动正常，无跛行等情况。

1.2.2自体富集骨髓干细胞提取 实验动物用2.5%戊巴比妥钠溶液以40mg/kg的剂量行耳静脉麻醉，麻醉成功后于双侧髂后上棘备皮、消毒铺巾，用15号20mL注射器刺入髂骨的松质骨内，共采集30～40mL左右骨髓血，置入含肝素（含25 000U）的储血袋中。运用全封闭血细胞分选系统（COBE 2991 Cell Processor，美国GAMBRO BCT.Inc），对采集的骨髓血进行快速细胞分选。速度3000r/min，离心5～7min。分选过程中逐步富集的骨髓有核细胞层，通过分流管路，收集回收备用。

1.2.3移植物准备 自制一套直径4.0mm左右的圆形环钻。采用此环钻切取髂骨松质骨圆柱3条，每条直径4.0mm、高5.0mm，用生理盐水浸泡去除残留的血液，再用纱布吸干，而后将已收集的自体骨髓干细胞用注射器注入，体外凝固备用。

1.2.4手术方法 麻醉成功后将实验兔仰卧位固定于手术台上，常规消毒，采用膝关节前内侧切口，暴露关节面，用利刀切除股骨髁全层关节软骨达关节软骨表面积的20%以上,制成关节软骨大面积缺损模型，实验组将已准备好的含自体富集骨髓干细胞松质骨条植入缺损区，并使表面平整，对照组仅作局部止血处理，全部实验手术于2天内完成。实验动物术后均肌肉注射青霉素16万单位，1天1次，共3天。并使其在开阔环境中自由活动。

1.2.5观察指标及方法 各实验动物于术后4、8、12周分批行空气栓塞处死，取股骨髁移植区及造模区为标本。①活体观察:实验动物的关节活动度采用改良的Clake weeknesser检查标准（固定髋关节，距膝关节远侧相等距离悬挂同等重量砝码，测量膝关节活动度）。②再生软骨面积百分比的观察：运用电脑测量软件以多点面积平均法测量标本再生软骨的表面积并计算再生软骨的表面积与造模缺损面积的百分比。③电镜观察：将所得标本分别做苏木精-伊红染色和Masson染色切片，在电镜下观察，以了解再生组织的种类和形态。

1.2.6统计学方法 应用SPSS10.0软件，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1活体观察 术后1周内，两组动物活动均减少并伴有跛行及双膝略肿胀等情况；1周后逐渐减轻，直至正常行走。术后4、8、12周时各观察时点实验组关节活动度均优于对照组（P＜0.01），实验组在术后12周的膝关节活动度已基本接近正常。见表1。

表1 两组动物膝关节活动度比较（） 度

表1 两组动物膝关节活动度比较（） 度

注：与对照组比较，*P＜0.01

?

2.2再生软骨面积百分比观察 术后12周，实验组大白兔膝关节再生软骨的表面积已基本完全填充造模缺损区，而对照组造模区缺损依然严重，仅修复20%左右，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 两组动物再生软骨表面积百分比比较（） %

表2 两组动物再生软骨表面积百分比比较（） %

注：与对照组比较，*P＜0.01

?

2.3大体标本观察 实验组再生软骨与周边软骨愈合良好，再生软骨的厚度为周边正常软骨的三分之二左右，表面较光滑平整，无凹陷。实验组再生软骨表面光滑平整，周围和正常软骨组织接合较好，而对照组再生软骨表面凹陷，色泽泛黄，厚度较薄，见图1（封二）。

2.4组织学电镜观察 术后12周，实验组造模缺损区被再生软骨组织覆盖，表面光滑平整，周围和正常软骨组织接合较好，基质染色变深，软骨细胞数量增多，且大多为透明软骨细胞，可见潮线。见图2（封二）。

3 讨 论

关节软骨损伤后由于其特殊的生物学特点一般较难自我修复，特别是较大面积缺损（缺损面积＞2cm2，深度＞4mm）时无法自行修复。目前临床上主要应用方法有①微钻孔技术：该法通过特定工具钻透软骨下骨，直达软骨下松质骨，使松质骨内富含骨髓多能干细胞的凝血块集结在钻孔区，从而诱导钻孔区的软骨组织再生。此技术操作简单易行，为软骨缺损面积＜1cm2的患者的首选治疗方法[3-5]；②自体骨软骨的马赛克移植技术：该法是通过自体关节非负重区的骨软骨作为供体，通过特定工具，获取一定数量的骨软骨柱作为移植物，直接以马赛克技术镶嵌于缺损区，不需内固定。该方法可在关节镜下以微创手术的形式完成，并保持了移植体和移植区的紧密连接，具有取材方便，无排异，修复能力强等优点[4-5]。此外，有学者对自体取材区进行了进一步的探索[6]，但依然存在供区不足的情况，因此临床上面对大面积的软骨缺损尚无有效的修复方法。

实验研究方面主要集中在两个方面:①组织移植：即运用新鲜的自体或同种异体骨软骨作为移植材料。②细胞的移植：通过自体或异体骨髓干细胞的体外PCR扩增再辅以一定的框架载体形成工程化的软骨移植材料。此类研究主要集中在工程载体、种子细胞和调控因子等方面。载体包括天然和人工合成可降解的复合物如胶原、明胶、纤维蛋白和藻酸盐、聚酸乳、聚羟基乙酸及其共聚物等。种子细胞主要有软骨细胞、骨髓多能干细胞（BMSCs）和胚胎干细胞（ESs）等。调控因子种类繁多，其中以骨形态发生蛋白（BMP）的研究最多[6-9]。但该类方法操作复杂，技术要求较高，目前仅处于实验室研究阶段，如运用于临床尚待进一步的探索。

本实验证实含自体富集骨髓干细胞的松质骨移植在修复大面积兔关节软骨缺损时，对膝关节活动度、大体标本观察、修复的表面积比等均有良好的实验室数据支持，可以作为一种软骨移植的方法供临床上选择使用。

将实验动物自体松质骨作为移植载体，具有生物相容性好、无排斥反应、不需要内固定等优点；以富集的自体骨髓干细胞为种子细胞修复软骨缺损，避免了单纯松质骨中骨髓干细胞量少的缺点；并且也避免了细胞体外培养增殖（PCR）对时间、环境、设备、费用上的较高要求。本研究证实，修复大面积关节软骨缺损，在无法获取足够的自体骨软骨时，可采用含自体富集骨髓干细胞松质骨镶嵌移植技术修复缺损软骨[10]。

［1］董启榕，郑祖.自体嵌镶式骨软骨移植修复膝关节软骨缺损［J］.中华创伤杂志，2003，19（8）：461-462.

［2］张维春，高石军，陈百成，等.关节镜下自体骨软骨移植修复股骨关节面软骨缺损［J］.中华骨科杂志，2004，24（3）：158-161.

［3］Frisbie DD，Oxford JT，Southwood L，et al.Early events in cartilage repair after subchondral bone microfracture［J］. Clin Orthop Relat Red，2003，（407）：215-227.

［4］Sledge SL.Microfracture techniques in the treatment of osteochondral injuries［J］.Clin sports Med，2001，20（2）：365-377.

［5］Gobbi A，Nunag P，Malinowski K.Treatment of full thickness chondral lesion of the knee with microfracture in a group of athletes［J］.Knee Surg Sports Traumator Arthrosc，2005，13（3）：213-221.

［6］石仕元.关节镜下自体骨软骨移植修复股骨髁软骨缺损［J］.中华创伤杂志，2007，23（1）：863-864.

［7］陆宁，卢世壁，王维芳，等.采用自体成熟关节软骨细胞的软骨组织工程修复［J］.中华实验外科杂志，2005，22（3）：293-297.

［8］尹战海，韩健，刘淼，等.骨髓间充质干细胞复合骨基质明胶构建组织工程化软骨［J］.中华骨科杂志，2005，25（3）：170-175.

［9］ Wakitani S，Goto T，Pineda SJ，et al.Mesenchymal cellbased repair of large，full-thickness defects of articular cartilage［J］.J Bone Joint Surg（Am），1994，76（4）：579-592.

［10］应小樟，石仕元，胡德新，等.自体骨软骨移植与含富集骨髓干细胞松质骨移植修复兔关节软骨缺损［J］.中国中西医结合外科杂志，2010，16（6）：674-675.

Large Area Articular Cartilage Defect Repaired with Cancellous Bone Enriching Bone Marrow Stem Cells

HU Dexin,ZHU Bo,YING Xiaozhang,SHI Shiyuan.Department of Oethopedics,Zhejiang Province Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo evaluate the therapeutic efficacy of cancellous bone enriching bone marrow stem cells in treatment of large area defects of articular cartilage in weight-bearing joints.MethodsSixty knees from 30 adult rabbits were randomly divided into experimental and control groups（n=30 in each）.Full-thickness articular cartilage defects in the femoral condyle of the knees were created.Cancellous bone enriching bone marrow stem cells was implanted for repair of the defects in experimental group.Spontaneous evolution occurred in control group.Rabbits were sacrificed in both groups at 4,8 and 12 weeks.Range of motion,macroscopic,and histological evaluation were observed.ResultsThe range of motion was better in experimental group than that in control group at any time point（P＜0.01）;at 12 weeks,the range of motion was almost normal in experimental group.Cancellous bone enriching bone marrow stem cell transplant completely repaired the lesions,but complete repair were not seen in control group（only about 20%lesions were repaired）,with a significant difference between two groups（P＜0.01）. The articular cartilage defect was well healed with regenerated cartilage that was with a 2/3 thickness of normal cartilage with smooth surface.Histological examination also showed a complete repair in the defect by bone marrow stem cell-derived cartilage.ConclusionCancellous bone enriching bone marrow stem cell implantation can repair large,full-thickness articular cartilage defects by regenerating hyaline-like cartilage.

rabbit；cartilage；cancellous bone；implantation；bone marrow stem cells

2013-08-27

杭州市医药卫生科技重点项目（No.20070433Q20）

胡德新，E-mail：huhudexin@163.com