杭菊叶总黄酮含量测定

陈 伟张慧芳

1浙江省富阳市中医医院中药房 富阳 311400 2金华职业技术学院医学院

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杭菊叶总黄酮含量测定

陈 伟1张慧芳2

1浙江省富阳市中医医院中药房 富阳 311400 2金华职业技术学院医学院

杭菊叶；黄酮；含量

杭菊又称杭白菊，是菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序[1]，是著名的“浙八味”之一，杭白菊为药食同源药材，需求量大，但在采摘菊花的同时，大量的菊叶被丢弃，造成较大浪费。中医认为，菊花叶性平，味辛、甘，具有清肝明目，解毒消肿的功效，主要用于头风、目眩、疔疮、痈肿等症[2]，具有较高的药用价值。已有文献报道亳菊叶、野菊叶等含有黄酮等多种有效成分[3-6]，但对杭菊叶中所含的黄酮类成分的含量未见报道。浙江为杭菊叶道地产地，主产于桐乡等地，杭菊叶资源丰富，为了合理开发和综合利用杭菊叶，本文对杭菊叶中总黄酮进行了测定，为深入研究和综合利用开发提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1试剂与药材 芦丁（中国药品生物制品检定所，批号100080-201002）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠为分析纯（国药集团试剂公司）。杭菊叶：2013年秋季采于浙江桐乡，经金华职业技术学院医学院罗国海副教授鉴定为菊科植物 Chrysanthemum morifolium Ramat.的新鲜叶，60℃烘干，粉碎。同时采集同株的杭白菊，同法处理。

1.2仪 器 VU-265 FM紫外可见分光光度计（日本岛津），HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），XP205电子分析天平（瑞士梅特勒托利多）。

2 实验方法与结果

2.1对照品溶液制备 称取芦丁对照品约30mg，精密称定，置100mL量瓶中，加70%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀，即得。每1mL中含无水芦丁0.299mg。

2.2供试溶液制备 取杭菊叶粉末约0.2g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇20mL，称重，回流提取60min，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

精密吸取供试品溶液1mL，分别置25mL量瓶中，照“2.3标准曲线的制备”项下的方法，自“加70%乙醇至6mL”起依法测定吸光度，计算含量。

2.3线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL，分别置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加入1mol/L氢氧化钠溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，立即照紫外-可见分光光度法（2010版中国药典一部附录ⅤA），于510nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得吸光度Y与芦丁浓度X的回归方程：Y=9.447X+0.046，r=0.9997，线性范围为0.299～2.093mg。

2.4提取工艺优选 影响杭菊叶总黄酮提取的主要因素有提取方法、乙醇浓度、溶剂用量和提取时间等，因此对四个因素进行单因素考察。

2.4.1提取方法的考察 取杭菊叶粉末约0.2g，精密称定，分别置50mL圆底烧瓶中，精密加入50%乙醇20mL，称重，分别超声和回流提取60min，放凉，称重，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液，依法测定。

超声提取测定结果为6.49%，回流提取为8.41%，结果表明，回流提取的黄酮含量高于超声提取，因此选择回流为杭菊叶总黄酮提取方法。

2.4.2乙醇浓度考察 取杭菊叶粉末约0.2g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，分别精密加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%浓度的乙醇20mL，称重，回流提取，放凉，称重，用相应浓度的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述方法进行测定。结果乙醇浓度在50%～80%范围内时，测得总黄酮含量较高，且乙醇浓度为70%时，测得的总黄酮含量最高，为9.63%。因此，确定提取溶剂为70%乙醇。见表1。

表1 不同浓度乙醇总黄酮提取测定结果

表2 不同溶剂用量提取测定结果

表3 回收率试验结果

2.4.3溶剂用量考察 取杭菊叶粉末约0.5g，精密称定，置100mL圆底烧瓶中，分别精密加入70%乙醇10、15、20、25和30mL，称重，分别回流提取1h，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述方法进行测定。结果当溶剂超过20mL时，总黄酮含量变化不大。因此，确定提取溶剂用量为20mL。见表2。

2.4.4提取时间考察 取杭菊叶粉末四份，各约0.2g，精密称定，置50mL圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇各20mL，称重，分别回流提取0.5、1、1.5和2h，放凉，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照前述方法进行测定。

提取0.5h测定结果为7.86%，1h为9.63%，1.5h为9.81%，2h为9.79%，结果表明，随着回流时间的延长，测定结果增高，当回流时间＞1h时，总黄酮含量测定结果变化不明显，综合考虑将提取时间确定为1h。

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验 精密吸取对照品溶液4mL，供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，照“2.3线性关系考察”项下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，测定吸光度，测定六次。对照品溶液及供试品溶液吸光度的RSD分别为0.48%和0.69%，表明精密度良好。

2.5.2稳定性试验 精密吸取芦丁对照品溶液4mL，供试品溶液1mL，置于25mL量瓶中，照“2.3线性关系考察”项下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，每隔5min测定一次吸光度。对照品溶液及供试品溶液30min内吸光度的RSD分别为2.22%和2.39%，RSD均＜3%，结果表明对照品溶液和供试品溶液显色后在30min内稳定性良好。

2.5.3重复性试验 分别取杭菊叶粉末6份，照“2.2供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，照前述含量测定方法进行测定，测得总黄酮含量平均值为9.65%，RSD值为2.30%，表明本方法重复性良好。

2.5.4加样回收率试验 采用加样回收法试验。取已知总黄酮含量的杭菊叶0.1g，精密称定，共取6份，分别准确加入芦丁对照品适量，照“2.2供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，制备成供试品溶液，照前述含量测定方法进行测定，计算回收率。试验结果表明，芦丁平均回收率为101.2%（n= 6），RSD为2.7%。说明该测定方法测定结果准确。结果见表3。

2.6样品测定 分别称取杭菊叶、杭白菊粉末三份，每份0.2g，精密称定，照“2.2供试品溶液的制备”项下供试品溶液制备方法操作，照前述含量测定方法进行测定。见表4。

表4 传统加工及硫熏加工杭菊叶总黄酮含量测定结果

3 结 论

杭白菊在采收过程中，只利用了植株的很少部分，大量的杭菊叶弃之不用，通过对杭菊叶和同株花朵总黄酮含量的测定发现，杭菊叶中总黄酮含量高于杭白菊，因此，杭菊叶具有较大的开发利用潜力。

黄酮在很多天然药物中均有分布，具有广泛的药理活性，是天然药物开发利用研究的热点，杭菊叶中黄酮含量较高，但所含黄酮的种类是否和花相同，主要黄酮成分含量多少以及杭菊叶黄酮的药效作用如何均未见报道，因此，在进一步的工作中应进行相关研究，为杭菊叶的开发利用提供科学依据。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：292.

［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.第七册.上海：上海科学技术出版社，1999：810.

［3］任爱农，鞠建明.野菊不同部位的总黄酮含量测定［J］.中草药，1999，30（8）：589.

［4］何小珍，郭玉，徐小娜，等.野菊不同部位绿原酸和3，5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：72-75.

［5］何小珍，贺冬秀，喻翠云，等.野菊叶中绿原酸及木犀草素-7-O-葡萄糖苷测定［J］.南华大学学报（自然科学版），2010，24（4）：95-98.

［6］陈慧芳，吴德玲，金传山，等.正交设计优选亳菊叶总黄酮提取工艺［J］.安徽中医学院学报，2011，20（2）：67-69.

修回日期：2014-03-24

2014-02-12