流动注射分析测定牛奶中尿素的方法研究

沈东旭

摘要：

目的：寻找一种快速测定牛奶中尿素含量的分析方法。方法：样品中加入三氯乙酸溶液，高速离心后取5 mL清液，过0.22 μm水相滤膜（聚醚砜）后通过AA3流动注射分析仪在线测定尿素含量。结果：尿素浓度在0 - 300 mg/kg范围内，可获得良好线性，相关系数r为0.9996，检出限为5.3 mg/kg，在添加水平50和100 mg/kg条件下，回收率范围98.2 - 101 %，日内和日间精密度范围2.7 - 3.6 %。结论：该方法具有较高的稳定性，耐用性，精密度和准确度，操作简单，适用于牛奶中尿素含量的快速测定。

关键词：流动注射；尿素；牛奶

【中图分类号】

TU266+.2 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0234-02

尿素是乳液的常规组分并构成非蛋白氮的一部分^[1]。一般情况下，牛奶中尿素的正常含量范围为200 - 300 mg/kg。但是，個别不法商贩通过在鲜奶中人为添加尿素来提高总氮含量，这不仅影响了牛奶的营养价值，更重要的是给消费者身体健康造成危害^[2]。因此，建立一种牛奶中尿素含量的快速检测方法以加强对牛奶品质监管具有重要意义。

流动注射分析法，实现了尿素和试剂的在线混合反应，并将样品的分析和结果报告全部自动化，避免了人工操作的不稳定性，简化了操作程序。赵立晶^[3]等首次采用流动注射法测定奶制品中的尿素，使用在线透析去除脂肪等影响，方法简便，但是在线透析装置价格昂贵，且滤膜需要经常更换。本实验中我们采用新型的气泡隔断式流动分析仪，信号更加稳定，灵敏度更高，并通过降低样品量，很好消除了脂肪对检测的影响，取得了良好的效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂：

AutoAnalyzer 3（AA3）流动注射分析仪（德国SEAL公司）：尿素分析模块，520nm滤片；Millipore 超纯水设备（美国Millipore公司），分析天平BT224S（北京赛多利斯仪器系统有限公司），ST16R高速冷冻离心机（美国赛默飞公司），涡旋混合器Lab Dancer S25（德国IKA公司）

尿素（H2NCONH2），三氯乙酸（CCl3COOH），氨基硫脲（CH5N3S），二乙酰一肟（C4H7NO2），磷酸（H3PO4），硫酸（H2SO4），三氯甲烷（CHCl3）均为分析纯或者优级纯试。实验用水为Millipore纯水。

酸溶液：300 mL磷酸中加入10 mL浓硫酸，用纯水稀释至500 mL；可长期放置。

二乙酰一肟溶液：将5 g二乙酰一肟溶解在200 mL纯水中。可以保存两周。

氨基硫酸溶液：将0.25 g氨基硫脲溶解在100 mL纯水中。可以保存两周。

尿素标准溶液（100 μg/mL）：准确称取0.1000 g尿素于小烧杯中，加少量纯水溶解后转入1000 mL容量瓶中，加0.1 mL三氯甲烷并用纯水定容，此溶液每毫升含0.1 mg尿素。冷藏保存。移取适量尿素标准溶液，用15 %三氯乙酸溶液稀释定容，配制标准曲线。

1.2 样品前处理： 称取2.5 g样品于50 mL离心管中，加入22.5 mL 15 %三氯乙酸溶液，涡旋混合30 s。接着以7500 r/min，10 ℃高速离心5 min，然后用针筒吸取约5 mL清液，过0.22 μm水相滤膜（聚醚砜）后进行分析。

1.3 仪器参数： 测量波长为520 nm； 分析速率为40 个样/h； 取样时间60 s，冲洗时间30 s，在线加热温度为95 ℃。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件研究： 本实验中考察了环己烷除脂对实验的影响。同一份牛奶样品采用2种前处理方法。A方法同1.2，B方法比A方法多了一步，在离心后滤液中加入10mL正己烷，取下层液体5mL进行测定。配对T检验结果如表1所示，，查表得t（0.05，9）=2.26，tD

2.2 方法确证：

根据欧盟2002/657/EC^[4]的授权文件，确定方法的稳定性、耐用性、线性范围、检出限、回收率以及精密度等。

2.2.1 稳定性：

通过调节样品的冷藏时间和分析时间，4℃下保存0，1，7，14，21天；将称量后的牛奶放在空气中0，5，10，30，60 min后进行分析，结果显示，实验数据没有显著差异，尿素在本实验条件下十分稳定，所以实验周期可以很长。

表1 2种方法测定尿素含量的数据对比

2.2.2 耐用性：

实验中考察了最重要的因素三氯乙酸浓度对结果的影响，分别使用10%，12%，15%，20%，25%三氯乙酸提取同一份牛奶中的尿素。实验结果显示，尿素的回收率在92.5-102%之间，对实验结果没显著性影响。说明此方法允许三氯乙酸浓度在较宽的范围内变化，增加了方法的可操作性。

2.2.3 线性范围和检出限：

配制系列质量浓度（0、10、50、100、150、200、300 mg/kg）的尿素进行测定，以质量浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线。尿素浓度在0 - 300 mg/kg范围内具有良好的线性关系，线性方程为Y=0.1915x+0.3169，r=0.9996（x是尿素浓度，mg/kg；Y是峰高百分比，%）

根据EPA关于方法检出限的定义，对20 mg/kg的尿素标准溶液平行前处理8份，测定峰高，并换算到尿素浓度并计算标准偏差S。检出限：DL=S * t（n-1，0.99）（S是平行测定的标准偏差；t（n-1，0.99）是置信区间99 %，自由度为n-1时的t值，当n=8， t（7，0.99）=2.998）。根据计算，检出限为5.3 mg/kg。

2.2.4 精密度和回收率： 在同一份牛奶样品中，添加尿素标准溶液，添加水平为50， 100 mg/kg，测定3天，每天重复6次，回收率和精密度结果见表2。

表2 方法的精密度和准确度

2.3 实际样品分析：

对市场上常见的10种牛奶样品中的尿素进行检测，如表1，结果显示，尿素含量范围为187.8 - 281.1 mg/kg。

3 结论

本文介绍了一种用于牛奶中尿素含量的大批量快速测定方法。采用三氯乙酸溶液作为提取试剂，提取液直接通过AA3流动分析仪进行检测。操作简单，消耗溶剂少，每小时可以分析40个样品，为鉴别牛奶中是否掺加尿素提供了一种有效的测定方法。

参考文献

[1] 赵旭博， 董文宾， 王顺民等. 国外牛奶中尿素含量检测新进展[J]. 食品研究与开发， 2004， 25 （6）： 109 - 114

[2] 翟永信编. 食品掺伪监测方法[M]. 北京： 北京大学， 1992

[3] 赵立晶， 闫杰， 马东升等. 在线透析-流动注射光度法测定奶及奶制品中尿素含量[J]. 分析化学， 2011， 39（2）： 183-187

[4] 2002/657/EC， Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun. 2002， L221， 8 - 36.