黄芩苷联合NB-UVB对黑素细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响

姚 蕾,钟淑霞,兰珊珊,宋 洋,周俊峰,李珊山

(吉林大学第一医院皮肤科,吉林长春 130021)

黄芩苷联合NB-UVB对黑素细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响

姚 蕾,钟淑霞,兰珊珊,宋 洋,周俊峰,李珊山

(吉林大学第一医院皮肤科,吉林长春 130021)

目的:观察体外培养的人正常黑素细胞经黄芩苷和窄波紫外线(NB-UVB)处理后细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的变化,为白癜风的新疗法研究提供理论依据。方法:人正常黑素细胞分为空白对照组、不同浓度黄芩苷组、不同剂量NB-UVB组及黄芩苷和NB-UVB联合组。应用MTT法检测各组黑素细胞增殖率,应用NaOH裂解法测定黑素水平,应用多巴氧化法测定酪氨酸酶活性。结果:与空白对照组比较, 1×10－4mol·L－1黄芩苷及30 mJ·cm－2NB-UVB组黑素细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05)。与空白对照组比较,黄芩苷组、NB-UVB组及联合组黑素水平及酪氨酸酶活性均增加(P＜0.05或P＜0.01);与黄芩苷组和NB-UVB组比较,联合组黑素水平和酪氨酸酶活性均增加(P＜0.01)。结论:黄芩苷与NB-UVB联合应用较2种方法单独应用具有更好的促黑素合成效果。

黑素细胞;黄芩苷;窄波紫外线;黑素;酪氨酸酶

白癜风为常见的色素脱失性皮肤病,病因复杂,治疗困难[1]。窄波UVB(narrow band-UVB, NB-UVB)由于其不良反应小、疗效显著而广泛用于白癜风的治疗。中药黄芩(Radix Scutellariae)为唇形科多年草本植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的根,中医常用来治疗白癜风。已有报道[2-4]证实:黄芩具有促进黑素瘤细胞及黑素细胞黑素合成的作用,但黄芩与NB-UVB联合应用对黑素细胞影响的研究尚少。本研究观察黄芩苷联合NB-UVB对体外培养的人正常黑素细胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影响,以期为白癜风的新疗法研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂黄芩苷(相对分子质量446.37)、EDTA和二甲基亚砜(DMSO)等均购自美国Sigma公司,F12培养液、胰酶、PBS和胎牛血清等均购自美国Invitrogen公司,左旋多巴购自百灵威公司,Triton X-100购自美国Amerisco生物公司,黑素细胞培养液添加剂碱性成纤维细胞长生因子(bFGF)购自美国Peprotech公司,IBMX购自美国Sigma公司。

1.2 原代黑素细胞培养取小儿包皮环切术后标本(吉林大学第一医院泌尿外科提供),去除皮下组织后分割成0.5 cm×1.0 cm条形组织块,胰酶4℃消化过夜;分离表皮与真皮,将细胞刮下,吹打成细胞悬液,离心后计数,以(6～8)× 106m L－1的密度接种于12.5 cm2培养瓶中,采用Hu16培养基[5]。24 h后换液,培养第3天加入G-418除去角质形成细胞及成纤维细胞,1周后可得到纯黑素细胞。待细胞生长至80%融合传代,同时进行多巴染色鉴定。取第3～4代细胞进行实验。

1.3 实验分组实验分为空白对照组、不同浓度黄芩苷组、不同剂量NB-UVB组及黄芩苷和NB-UVB联合组。黄芩苷组黄芩苷终浓度分别为1×10－4mol·L－1(0.04 g·L－1)、1× 10－3mol·L－1(0.4 g·L－1)和1× 10－2mol·L－1(4 g·L－1);NB-UVB组UVB剂量分别为30、60、90和120 mJ·cm－2。选取不影响黑素细胞生长的黄芩苷浓度及UVB剂量联合作为联合组。

1.4 MTT法检测黑素细胞增殖黄芩苷组:将培养至第3代的黑素细胞接种于96孔板,每孔5×103个细胞,24 h后换液,加人含黄芩苷的培养液(终浓度为1×10－4、1×10－3和1× 10－2mol·L－1,并设空白对照)。继续培养72 h 后,弃上清,每孔加入1 g·L－1MTT溶液,4 h后吸出液体,每孔加入DMSO 100μL,于酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度(A490)值,每个浓度重复3次。

NB-UVB组:隔日照射1次,共3次(剂量分别为30、60、90和120 mJ·cm－2,并设空白对照)。光源距细胞培养板10 cm,照射完毕后继续培养24 h,弃上清,每孔加入1 g·L－1的MTT溶液,4 h后吸出液体,每孔加入DMSO 100μL,于酶标仪490nm波长处测定各孔A490值,每个剂量重复3次。

计算细胞增殖率,细胞增殖率＝处理组A490值/空白对照组A490值×100%。选取对黑素细胞生长无影响的黄芩苷浓度及NB-UVB剂量联合处理黑素细胞作为联合组,检测其黑素水平及酪氨酸酶活性。

1.5 黑素水平的检测采用NaOH裂解法测定各组细胞黑素水平。将细胞接种于6孔板,每孔1× 104个细胞,取各组细胞培养7 d后,胰蛋白酶消化脱皿,离心后去上清,加入1 mol·L－1NaOH 于475 nm波长处测定A475值,对照黑素标准曲线,计算出黑素水平。黑素水平＝实验组A475值/空白对照组A475值×100%。

1.6 酪氨酸酶活性的检测细胞接种于96孔板,每孔5×103个细胞,24 h后换液,细胞分组方法同上。细胞分组处理结束后PBS洗涤2次,加入100μL 1%Triton X-100,震荡5 min后每孔加入0.1%L-Dopa 100μL,同时使用L-Dopa的自动氧化进行校正,37℃孵育30 min,于酶标仪490 nm波长处测定A490值。酪氨酸酶活性＝实验组A490值/空白对照组A490值×100%。

1.7 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组黑素细胞增殖率、黑素水平和酪氨酸酶活性以±s表示,组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 各组黑素细胞增殖率与空白对照组比较, 1×10－4mol·L－1黄芩苷组细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05),1×10－3及1×10－2mol·L－1黄芩苷组黑素细胞增殖率明显降低(P＜0.01),见表1。与空白对照组比较,30 mJ·cm－2NB-UVB组细胞增殖率差异无统计学意义(P＞0.05),60、90和120 mJ·cm－2NB-UVB组黑素细胞增殖率明显降低(P＜0.05或P＜0.01),见表2。因此取黄芩苷浓度10－4mol·L－1及NB-UVB剂量30 mJ·cm－2为处理条件测定黑素细胞黑素水平及酪氨酸酶活性。

表1 不同浓度黄芩苷作用下黑素细胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of melanocytes after treated with different concentrations of baicalin(n＝3,±s,η/%)

表1 不同浓度黄芩苷作用下黑素细胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of melanocytes after treated with different concentrations of baicalin(n＝3,±s,η/%)

∗P＜0.05 compared with blank control group.

Group Proliferation rate Blank control 100.00±0.00 Baicalin(mol·L－1) 10－493.84±10.96 10－362.55±5.94∗10－218.19±4.31∗

表2 不同剂量NB-UVB照射后黑素细胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of melanocytes after treated with different doses of NB-UVB(n＝3,±s,η/%)

表2 不同剂量NB-UVB照射后黑素细胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of melanocytes after treated with different doses of NB-UVB(n＝3,±s,η/%)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with blank control group.

Group Proliferation rate Blank control 100.00±0.00 NB-UVB(mJ·cm－2) 30 100.19±5.87 60 75.53±7.04∗90 51.33±9.54∗120 13.88±4.73∗∗

2.2 各组黑素细胞中黑素水平与空白对照组比较,黄芩苷组、NB-UVB组及联合组黑素细胞中黑素水平均增加,差异有统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01),联合组黑素水平与黄芩苷组及NB-UVB组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

2.3 各组黑素细胞中酪氨酸酶活性黄芩苷组及NB-UVB组黑素细胞中酪氨酸酶活性与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),联合组酪氨酸酶活性与黄芩苷组及NBUVB组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表3。

3 讨论

白癜风的治疗以促进黑素细胞增殖及黑素合成为主要目标,酪氨酸酶是黑素合成的限速酶,其表达及活性影响黑素生成的速度及产量[6],因此如能有效增加黑素细胞酪氨酸酶的活性,则可提高白癜风的治疗效果。

表3 各组黑素细胞中黑素水平和酪氨酸酶活性Tab.3 Melanin levels and tyrosinase activities in melanocytes in various groups(±s,η/%)

表3 各组黑素细胞中黑素水平和酪氨酸酶活性Tab.3 Melanin levels and tyrosinase activities in melanocytes in various groups(±s,η/%)

∗P＜0.05,∗∗P＜0.01 compared with blank control group;△P＜0.01compared with baicalin group;＃P＜0.01 compared with NB-UVB group.

Group Melanin Tyrosinase activity Blank control 100.00±9.00 100.00±0.00 Baicalin 134.14±7.14∗125.22±6.01∗NB-UVB 133.98±9.30∗143.69±8.92∗Combined 277.49±10.17∗∗△＃255.26±25.98∗∗△＃

NB-UVB是临床治疗白癜风的可靠方法[7-9],但体外实验多表明大剂量的NB-UVB照射会导致黑素细胞增殖活性降低。国内王奕等[10]报道:体外培养的黑素细胞在接受≥60 mJ·cm－2的NB-UVB照射后呈负增殖,而黑素合成则随NBUVB剂量增加呈剂量依赖式递增;朱建伟等[11]的研究也证明:体外培养的黑素细胞在接受60～90 mJ·cm－2的UVB照射后细胞受损。根据Hu[12]的报道:黑素细胞在衰老及接近死亡时黑素生成会明显增加,因此若探讨对黑素细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响,使用对黑素细胞增殖活性无影响的NB-UVB剂量才是可靠的。本研究结果表明:当NB-UVB剂量为30 mJ·cm－2时细胞生长未受抑制,而增加剂量后黑素细胞生长受抑,因此选用该剂量进行后续研究。

黄芩苷对黑素细胞增殖及黑素合成影响的报道很少。国内学者罗增香等[2]报道:5～160 mg·L－1黄芩苷对共培养体系中的黑素细胞增殖无抑制作用,而10～40 mg·L－1黄芩苷促进黑素细胞增殖。本研究结果显示:黄芩苷浓度为1× 10－4mol·L－1(0.04 g·L－1)时对黑素细胞生长无影响,但浓度为1×10－3mol·L－1及1× 10－2mol·L－1时则抑制黑素细胞增殖,说明高浓度黄芩苷仍会对黑素细胞造成损伤。本研究结果也显示:对黑素细胞增殖无影响的黄芩苷浓度可促进黑素合成及增加酪氨酸酶活性,说明低浓度黄芩苷可安全有效地增强黑素细胞功能。

关于黄芩苷联合NB-UVB对黑素细胞功能的影响并与单独应用黄芩苷或单独应用NB-UVB照射进行比较的研究尚未见报道。本研究结果显示:1×10－4mol·L－1黄芩苷与30 mJ·cm－2NB-UVB照射联合应用可明显提高黑素细胞中黑素水平及酪氨酸酶活性,且与单独黄芩苷组及单独NB-UVB组比较差异均有统计学意义。有学者[13]研究表明:体外培养的人黑素细胞接受高剂量NB-UVB照射时黄芩苷可起到保护作用,可使黑素细胞耐受更高剂量的NB-UVB照射而增殖活性不受影响。因此应用黄芩苷后是否可联合应用更大剂量的NB-UVB照射来促进黑素细胞合成黑素可作为下一步研究的重点。本研究初步证明:黄芩苷与NB-UVB联合应用较2种方法单独应用具有更好的促黑素合成的作用,本研究结果为黄芩苷联合UB-UVB治疗白癜风提供了理论依据。

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Influence of baicalin combined with NB-UVB on melanin synthesis and tyrosinase activity in melanocytes

YAO Lei,ZHONG Shu-xia,LAN Shan-shan,SONG Yang,ZHOU Jun-feng,LI Shan-shan
(Department of Dermatology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo observe the synthesis of melanin and tyrosinase activity of the cultured normal human melanocytes after treated with baicalin and NB-UVB,and to provide theoretical evidence for study on the new therapy method of vitiligo.MethodsThe normal human menlanocytes cultured in vitro were divided into control group,different concentrations of baicalin groups,different doses of NB-UVB group and baicalin combined NBUVB group.The proliferation rate of melanocytes was measured by MTT assay,the level of melanin was tested by NaOH pyrolysis,and the tyrosinase activity was measured by dopa oxidization.ResultsCompared with control group,the proliferation rates in 10－4mol·L－1baicalin group and 30 mJ·cm－2NB-UVB group had no significant difference(P＞0.05).Compared with control group,the levels of melanin and tyrosinase activities in baicalin group,NB-UVB group and combined group were increased(P＜0.05 or P＜0.01);compared with baicalin group and NB-UVB group,the level of melanin and tyrosinase activity in combined group were increased(P＜0.01).ConclusionBaicalin combined with NB-UVB has better promotion effect on melanin synthesis than used alone.

melanocytes;baicalin;narrwo band-UVB;melanin;tyrosinase

R285;R75

A

2013-11-26

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20110478);吉林省中医药管理局中医药科技项目资助课题(2006)

姚 蕾(1983－),女,黑龙江省大庆市人,医学硕士,主要从事白癜风发病机制及治疗方面的研究。

李珊山(Tel:0431-88782615,E-mail:shansalee＠163.com)

时间: 2014-08-27 14:44

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1444.004.html

1671-587Ⅹ(2014)05-1024-04

10.13481/j.1671-587x.20140523