阿托伐他汀对同型半胱氨酸作用下人脐静脉内皮细胞Bcl-2启动子区甲基化水平的影响及其抗动脉粥样硬化机制

李 录,侯建军,邱荣荣,贾绍斌,丛广志,孙 娜

(1.南京医科大学附属无锡市第二人民医院心内科,江苏无锡 214002;2.宁夏医科大学总医院心脏中心心内科,宁夏银川 750004;3.陕西省渭南市中心医院心内科,陕西渭南 714000)

阿托伐他汀对同型半胱氨酸作用下人脐静脉内皮细胞Bcl-2启动子区甲基化水平的影响及其抗动脉粥样硬化机制

李 录1,侯建军2,邱荣荣1,贾绍斌2,丛广志2,孙 娜3

(1.南京医科大学附属无锡市第二人民医院心内科,江苏无锡 214002;2.宁夏医科大学总医院心脏中心心内科,宁夏银川 750004;3.陕西省渭南市中心医院心内科,陕西渭南 714000)

目的:探讨阿托伐他汀对同型半胱氨酸(Hcy)作用下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)Bcl-2基因启动子区甲基化水平及其表达的影响,阐明阿托伐他汀抗动脉粥样硬化(AS)的可能机制。方法:HUVECs分别采用含有0、2、4、8、16和32 mmol·L－1Hcy的RPMI 1640培养液作用48 h,采用MTT实验检测细胞增殖抑制率及半数抑制浓度(IC50),根据IC50结果将本实验分为对照组(0 mmol·L－1Hcy)、Hcy组(9.00 mmol·L－1Hcy)、阿托伐他汀组(9.00 mmol·L－1Hcy＋1×10－3mmol·L－1阿托伐他汀)。各组细胞培养48 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光定量PCR法检测Bcl-2基因的m RNA表达,Western blotting法检测Bcl-2蛋白表达水平,甲基化特异性PCR(MSP)联合巢式降落式PCR法检测Bcl-2启动子区甲基化水平。结果:与对照组比较,Hcy组细胞凋亡率上升(P＜0.01),Bcl-2基因m RNA及蛋白表达水平下降(P＜0.01), Bcl-2基因启动子区甲基化水平降低(P＜0.01);与Hcy组比较,阿托伐他汀组内皮细胞凋亡率下降(P＜0.01), Bcl-2基因m RNA及蛋白表达水平增加(P＜0.05),Bcl-2基因启动子区甲基化水平升高(P＜0.05)。结论:阿托伐他汀可通过调节Hcy作用下的HUVECs Bcl-2基因甲基化水平抑制细胞凋亡。

阿托伐他汀;动脉粥样硬化;同型半胱氨酸;Bcl-2蛋白;DNA甲基化;细胞凋亡

高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, H Hcy)是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的独立危险因素[1-2]。HHcy致AS的机制并不完全清楚,有报道[3]显示:AS的发生与内皮细胞的凋亡有关。同型半胱氨酸(homocystein,Hcy)的代谢过程可引起DNA甲基化水平的改变[4-6]。Bcl-2基因是调节凋亡的关键基因,本课题组前期的动物实验研究[7]发现:HHcy大鼠主动脉的Bcl-2基因发生了去甲基化,致Bcl-2表达水平改变,引起平滑肌细胞凋亡失衡,从而导致AS的发生。阿托伐他汀是1种3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-Co A)还原酶抑制剂。他汀类药物能有效降低胆固醇,在AS的治疗中发挥了重要的作用。但他汀类药物对AS的治疗作用并不能完全以降低胆固醇的作用来解释,非降脂相关的心血管保护作用,受到学者广泛的重视[8]。阿托伐他汀是否可以通过调节Bcl-2启动子区甲基化水平而影响内皮细胞凋亡程度,从而起到延缓AS的进展少见报道。本实验通过研究阿托伐他汀对Hcy作用下人脐静脉内皮细胞(human umbilical endothelial cells,HUVECs)的Bcl-2启动子区甲基化水平及表达的影响,探讨阿托伐他汀拮抗HHcy致AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器HUVECs株(ATCC公司,美国);Hcy(Sigma公司,美国), RPMI 1640培养液(Hyclone公司,美国),胎牛血清(北京全氏金生物技术有限公司),MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司),Trizol试剂(Invitrogen公司,美国),兔源多克隆抗Bcl2抗体(武汉三鹰生物技术有限公司), EZ DNA Methylation-GoldTMKit和DNA甲基化阳性对照(ZYMO公司,美国),DNA提取纯化试剂盒、SYBR Green qPCR supermix和2×Gotag Green Master Mix(Promega公司,美国);CO2培养箱(Heal Force公司,德国),倒置显微镜(Olympus公司,日本),单激光三色流式细胞仪(BD公司,美国),荧光定量PCR仪(Roche公司,瑞士),蛋白电泳、转移装置系统(Bio-Rad公司,美国)。Bcl-2 mRNA引物及甲基化特异性PCR (MSP)引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.2 HUVECs培养及实验分组细胞培养:以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,在5%CO2、37℃饱合湿度的培养箱中培养HUVECs,隔日更换培养液。用0.25%胰酶常规消化、传代。实验分组:对照组(RPMI 1640培养液＋HUVECs)、Hcy组(RPMI 1640培养液＋HUVECs＋Hcy)和阿托伐他汀组(RPMI 1640培养液＋HUVECs＋Hcy＋阿托伐他汀)。作用时间为48 h。放置Hcy浓度由MTT实验计算得出的IC50确定;阿托伐他汀终末浓度为1×10－3mmol·L－1。

1.3 MTT法测定细胞增殖生长能力分别采用含0、2、4、8、16和32 mmol·L－1Hcy的培养液作用细胞48 h,参照细胞增殖实验试剂盒说明书操作,于酶标仪490 nm波长处检测吸光度(A) 值,并计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝[1－(对照组A值－实验组A值)/对照组A值]×100%。计算IC50公式如下:lg IC50＝XK-d/2∑(Pi＋Pi＋1)[9]。Xk:lg最大剂量; d:最大及相邻2组剂量对数之差;Pi,Pi＋1:为第i组及i＋1组抑制率。

1.4 流式细胞术测定细胞凋亡用0.25%胰酶消化、收集细胞,用冷PBS洗涤细胞3次,400μL 1×AnnexinⅤ结合液悬浮细胞,浓度约为1×106m L－1。加入5μL 1×Annexin V-FITC染色液,4℃避光孵育15 min。加入10μL PI染色液后混匀4℃避光孵育5 min。以流式细胞仪进行检测,激发波长为488 nm。实验结果以细胞早期和晚期凋亡率之和表示。

1.5 荧光定量PCR法测定Bcl-2基因mRNA表达采用Trizol法提取细胞总RNA,每组取1 mg 总RNA,反转录为cDNA。配制20μL PCR反应体系:无核酶水5.2μL、上下游引物各0.4μL,引物序列(上游引物:5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′;下游引物:5′-ACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′)、cDNA 4μL、SYBR Green qPCR supermix,10μL。反应条件:95℃、2 min,1个循环;95℃、15 s,60℃、1 min,共40个循环;以β-actin为内参照,m RNA表达水平以2－△△ct值表示。

1.6 Western blotting法测定Bcl-2蛋白表达采用凯基生物全蛋白提取试剂盒,行全蛋白的提取, BCA法测定蛋白表达水平。将蛋白样本加入等体积的2×上样缓冲液,沸煮变性。每孔加入60μg样品行SDS-PAGE电泳转膜;丽春红染膜;封闭;加入一抗4℃过夜。洗膜后加二抗室温孵育1 h; TBST洗膜;滴加ECL化学发光液,避光孵育1 min,暗室中曝光5 min。Image J图像分析系统测定A值,以β-actin为内参照,蛋白表达水平以目标条带A值与内参照条带A比值表示。

1.7 DNA提取及亚硫酸盐修饰按照DNA提取纯化试剂盒说明书提取DNA,并测定其浓度。每组分别取500 pg DNA,用去离子水将其体积调整到20μL,加入130μL CT转化试剂,98℃孵育10 min,64℃孵育2.5 h,经脱硫后,用10μL溶解液洗脱DNA,－80℃保存。

1.8 甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法测定Bcl-2基因启动子区甲基化水平联合MSP及巢式降落式PCR。使用Methptimer软件设计Bcl-2(NM_138764)外引物和MSP引物(外引物:上游引物,5′-GTTTTGTTTTTATTTATTTAGTAGTTTTT-3′,下游引物,5′-AATCCTATAATATTTTCCCCTTCTC-3′,产物长度224 bp;甲基化引物:上游引物, 5′-GTTTTCGTTTTCGGTTTTTTTATC-3′,下游引物,5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCGAC-3′,产物长度146 bp;非甲基化引物:上游引物,5′-TTTTTGTTTTTGGTTTTTTTATTGT-3′,下游引物,5′-CCTATAATATTTTCCCCTTC TCAAC-3′,产物长度145 bp。建立50μL PCR体系:2×Gotag Green Master Mix,25μL,无核酶水20μL、上下游引物各1μL、DNA模板3μL。反应条件:95℃预变性10 min, 1个循环;95℃变性30 s,退火温度68℃→48℃,每个循环降低1℃,72℃延伸30 s,共扩增20个循环;50℃退火温度下再扩增30个循环。PCR产物行2.5%琼脂糖凝胶电泳,以Quantity One软件测量条带灰度(A)值。Bcl-2基因启动子区甲基化水平检测结果以甲基化A值与非甲基化条带A值之比(M·U－1)表示。同时设置DNA甲基化阳性对照及以水为模板的空白对照。

1.9 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。各组A值、细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、m RNA和蛋白表达水平以及甲基化水平均以±s表示,组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 HUVECs增殖抑制率随着Hcy浓度的增加,A值由0.99±0.05渐降低至0.28±0.03,细胞增殖抑制率由0.00上升到71.72%。与对照组比较,各Hcy组A值下降,细胞增殖抑制率上升,且呈剂量效应关系(P＜0.01)。根据公式计算出IC50为9.28 mmol·L－1,取其近似值9.00 mmol·L－1作为后续实验Hcy浓度。见表1。

表1 MTT法检测各组HUVECs增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of HUVECs in various groups detected by MTT(n＝6)

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率第一象限为晚期凋亡细胞,第四象限为早期凋亡细胞,将2个象限之和即为细胞凋亡率。对照组的细胞凋亡率为(2.30±0.60)%,Hcy组为(16.40±0.73)%, 2组间比较差异有统计学意义(P＜0.01),阿托伐他汀组细胞凋亡率[(8.35±0.33)%]较Hcy组降低(P＜0.01)。见图1。

2.3 Bcl-2基因m RNA的表达采用2－△△ct法对数据进行统计分析。对照组Bcl-2基因m RNA相对表达水平为1.00±0.00,Hcy组Bcl-2基因m RNA相对表达水平为0.45±0.14,与对照组比较,Hcy组Bcl-2基因m RNA表达水平明显下降(P＜0.01);阿托伐他汀组Bcl-2基因m RNA相对表达水平为0.64±0.04,与Hcy组比较,阿托伐他汀组Bcl-2基因m RNA表达水平明显升高(P＜0.05)。

图1 流式细胞术检测各组HUVECs凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of HUVECs in various groups detected by FCMA:Control group;B:Hcy group;C:Atorvastatin group.

2.4 Bcl-2蛋白的表达对照组Bcl-2蛋白表达水平为0.89±0.04,Hcy组Bcl-2蛋白表达水平为0.56±0.05,与对照组比较,Hcy组Bcl-2蛋白表达水平下降(P＜0.01);阿托伐他汀组Bcl-2蛋白表达水平为0.67±0.02,与Hcy组比较,阿托伐他汀组Bcl-2蛋白表达水平升高(P＜0.05)。见图2。

图2 Western blotting法检测各组HUVECs中Bcl-2蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 protein in HUVECs in various groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:Hcy group;Lane 3:Atorvastatin group.

2.5 MSP法检测Bcl-2基因启动子区甲基化水平

对照组Bcl-2基因启动子区甲基化水平(M·U－1)比值为1.96±0.26,Hcy组为1.20± 0.19,与对照组比较,Hcy组Bcl-2基因启动子区甲基化水平下降(P＜0.01);阿托伐他汀组(M·U－1)比值为1.58±0.08,与Hcy组比较,阿托伐他汀组Bcl-2基因启动子区甲基化水平升高(P＜0.05)。见图3。

图3 各组HUVECs中Bcl-2启动子区甲基化水平检测电泳图Fig.3 Electrophoregram of detection of Bcl-2 promoter region methylation levels in HUVECs in various groupsM:Marker;Lane 1,2:Control group;Lane 3,4:Hcy group;Lane 5, 6:Atorvastatin group;Lane 7,8:Positive control group;Lane 9,10: H2O;Lane 1,3,5,7,9:Methylation bands(146 bp);Lane 2,4,6,8, 10:Non-methylation bands(145 bp).

3 讨论

有研究[10]表明:H Hcy致AS作用与其促进血管内皮细胞的凋亡有关,且Bcl-2基因在细胞凋亡过程中起到了重要的抑制性调节作用。近年来随着表观遗传学研究的深入,研究者[11]发现DNA甲基化与心血管疾病,特别是AS的关系密切。DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶的作用下,使5′-Cp G-3′二核苷酸上胞嘧啶发生甲基化,从而形成5-甲基胞嘧啶[12]。CpG二核苷酸主要存在于基因启动子区的Cp G岛[13]。Cp G岛甲基化后一方面可直接干扰转录因子与DNA调控区域的结合,另一方面则可间接与甲基结合蛋白相结合,占据转录因子在DNA上的结合位点,影响基因的转录和表达,基因就可通过对CpG位点甲基化状态的调控而实现对基因表达水平的调控,影响其生物学特征。

阿托伐他汀是一种HMG-Co A的选择性抑制剂,能抑制HMG-Co A还原酶和胆固醇在肝脏的生物合成,并增加肝细胞表面的低密度脂蛋白(LDL)受体数目而增加LDL的摄取和分解,同时能不同程度地提高血浆高密度脂蛋白胆固醇的水平,在抗AS的过程中起到了不可替代的治疗作用。研究[14]发现:阿托伐他汀可通过上调Bcl-2基因的表达而延缓血管内皮细胞的衰老和凋亡。Bcl-2基因是调节细胞凋亡的关键基因,可通过抑制细胞色素C向胞浆的释放,阻止Caspase-9前体的活化,从而最终阻止Caspase-3的活化,防止凋亡的发生。但Bcl-2甲基化在阿托伐他汀延缓细胞凋亡的过程中是否起到了调节性作用并不清楚。因此本实验通过观察阿托伐他汀对Hcy作用下HUVECs的Bcl-2基因启动子区甲基化水平及表达的影响,探讨阿托伐他汀降脂作用以外的可能潜在的抗AS机制,为阿托伐他汀抗AS的非降脂相关作用提供新的解释。

本实验结果显示:与对照组比较,Hcy组Bcl-2基因启动子区甲基化水平明显降低,Bcl-2基因m RNA和蛋白表达水平下降,HUVECs的增殖能力下降,凋亡水平明显增加。与Hcy组比较,阿托伐他汀组HUVECs的Bcl-2基因启动子区的甲基化水平上凋,同时Bcl-2基因的m RNA及蛋白表达水平明显升高,细胞的增殖能力增强,细胞凋亡水平下降。

Hcy是甲硫氨酸代谢过程中的重要中间产物,其代谢过程中生成的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)经其水解酶水解生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)和甲基,SAH经其水解酶水解形成Hcy。该过程中产生的甲基经甲基转移酶作用,可使基因组DNA发生甲基化。但当发生H Hcy时,反应趋向于生成SAH,SAH是甲基转移酶的强力抑制剂,可使DNA甲基化过程受阻,这与本次实验得到的Hcy可致Bcl-2启动子区去甲基化的结果在理论上是相符的。但Devlin等[15]发现:HHcy对鼠H19基因甲基化水平的影响在肝脏与主动脉组织中截然不同,提示Hcy对DNA甲基化水平的调节极其复杂,并可能有组织特异性。本实验结果显示:Hcy在致Bcl-2基因甲基化水平下调后,其m RNA和蛋白表达水平下降,内皮细胞凋亡增加,可能正是得益于内皮细胞的凋亡,吞噬了LDL的单核细胞才得以在动脉内膜下浸润,形成AS的早期病变。本实验结果显示:阿托伐他汀可以上调Bcl-2基因启动子区的甲基化水平,并上调其m RNA和蛋白的表达水平,对抗Hcy引起的内皮细胞凋亡。上述作用可以保持血管内膜的完整性,维持血管内皮的正常生物功能,防止泡沫细胞在血管内皮下的浸润,这可能是阿托伐他汀治疗AS的重要机制之一。

综上所述,阿托伐他汀可上调Bcl-2基因启动子区的甲基化水平,并增加其mRNA和蛋白的表达水平,对抗Hcy的致内皮细胞凋亡作用,是阿托伐他汀治疗AS的重要机制之一。目前存在的问题在于阿托伐他汀是HMG-Co A还原酶抑制剂,本身并不含有甲基集团,也不参与甲基代谢,阿托伐他汀如何影响Bcl-2基因启动子区甲基化水平尚有待深入的研究。

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Influence of atorvastatin in Bcl-2 methylation in cultured human umbilical endothelial cells treated with homocysteine and its mechanism of anti-arteriosclerosis

LI Lu1,HOU Jian-jun2,QIU Rong-rong1,JIA Shao-bin2,CONG Guang-zhi2,SUN Na3
(1.Department of Cardiology,Wuxi Second People’s Hospital,Nanjing Medical University,Wuxi 214002,China;2.Center of Cardiology,General Hospital,Ningxia Medical University,Yingchuan 750004, China;3.Department of Cardiology,Weinan Central Hospital,Shaanxi Province,Weinan 714000,China)

ObjectiveTo investigate the influence of atorvastatin in methylation and expression level of Bcl-2 in human umbilical endothelial cells(HUVECs)treated with homocysteine(Hcy)and to expound potential mechanism of atorvastatin resisting arteriosclerosis.MethodsAfter HUVECs were treated with 0,2,4,8,16,and 32 mmol·L－1Hcy for 48 h,MTT was used to measure the inhibitory rates of HUVECs and the half inhibitory concentration(IC50).According to the experimental results,the HUVECs cultured in vitro were divided into control group(0.00 mmol·L－1Hcy),Hcy group(9.00 mmol·L－1Hcy),and atorvastatin group (9.00 mmol·L－1Hcy＋1×10－3mmol·L－1atorvastatin).After treated for 48 h,flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of cells,the m RNA expression of Bcl-2 was analyzed by fluorescence quantitative PCR,the protein expression of Bcl-2 was detected by Western blotting method,and the methylation level of Bcl-2 promoter region was determined by nest touch-down PCR combined with methylation specific PCR(MSP).ResultsCompared with control group,the apoptotic rate of HUVECs in Hcy group was increased(P＜0.01),the mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were significantly decreased(P＜0.01),and the Bcl-2 promoter region methylation level was also decreased(P＜0.01).Compared with Hcy group,the apoptotic rate of HUVECs in atorvastatin group was decreased(P＜0.01),the m RNA and protein expression levels of Bcl-2 gene were increased (P＜0.05),and the Bcl-2 promoter region methylation level was also increased(P＜0.05).ConclusionAtorvastatin can prevent the apoptosis of HUVECs induced by Hcy through regulating Bcl-2 methylation.

atorvastatin;atherosclerosis;homocysteine;Bcl-2 protein;DNA methylation;apoptosis

R543.5

A

2013-09-04

宁夏回族自治区科技厅自然科学基金资助课题(NZ11266)

李 录(1978－),男,河北省张家口市人,医学硕士,主要从事冠状动脉粥样硬化发病机制的研究。

贾绍斌(Tel:0951-6743232,E-mail:jsbxn＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1002-05

10.13481/j.1671-587x.20140519