高效偶氮染料降解菌处理毛皮染色废水的研究

马宏瑞， 张兆鑫， 罗羿超， 朱 超

(1.陕西科技大学 资源与环境学院， 陕西 西安 710021； 2.普士顿兴业有限公司, 台湾 台南 71043)

0 引言

毛皮染色废水是一类成分复杂(含有不同种类的偶氮染料、蒽醌染料等)、高色度、高盐度、难降解的工业废水[1],因此导致经现有处理工艺处理后废水的各项指标很难达到直排中的一级排放标准(GB 30486-2013).

目前,工业废水的常规生化处理工艺有直接好氧、厌氧-好氧结合等方法[2,3].针对染色废水的处理，常用的生物法如活性污泥法等处理后的废水所能达到的处理效果并不理想，虽然其对BOD去除效果明显(一般可达80%左右),但对COD和色度的去除率却不高[4].因此，在生物处理中寻找一种对废水COD和色度有着良好去除效果的方法很有必要.

生物强化技术是一种针对目标污染物，在传统生物处理系统中投加具有特定功能菌剂的生物处理技术.近年来，采用生物强化技术处理各类废水的研究报道屡见不鲜，但多是针对单一模拟染料废水的处理[5]，而针对具体的毛皮染色废水处理的研究甚少.Sharma等[6]从印染厂废水沟渠及处理装置中分离出5株高效菌，经混合培养并固定化后投加到反应器中,发现其对三苯甲烷染料酸性蓝15的脱色率达到94 %；何芳等[7]的研究表明，当高效菌与活性污泥混合接种后，对印染废水COD、色度的去除率分别高于85%和75%，出水水质稳定，同时对温度、pH的适应范围较宽，微生物脱色活性高.采用强化菌剂投加法进行废水脱色处理，是目前的研究热点.

本研究进行了高效偶氮染料脱色降解菌株的筛选分离和复合菌剂的制备，并采用直投法对毛皮染色废水进行了处理，监测了处理过程中废水水质的变化情况，评估了其处理效果，可为毛皮染色废水的高效处理提供技术支持.

1 材料和仪器

1.1 供试材料

试验所用6株细菌从降解偶氮染料的厌氧污泥中分离纯化所得[8]，将其编号为菌a、b、c、d、e、f.将6株细菌复壮后涂布在含偶氮染料LB固体培养基上，作为接种纯培养物.

活性污泥取自西安市第五污水处理厂曝气阶段的好氧活性污泥.该厂主要处理生产废水及生活污水，出水水质执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)中的一级B类标准.

本试验所用毛皮染色废水取自浙江某毛皮厂，表1为其经过脱铬后的出水水质.

表1 毛皮染色废水的理化特性

1.2 主要仪器

420-BS型电热恒温培养箱(上海博泰)；HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳)；PHC-3C型雷磁pH仪(上海精科)；RH-QG型全温光照振荡器(金坛市金南仪器)；HS-1300-V型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；T-gradient型PCR仪(美国ABI)；Gel-Doc2000型凝胶成像仪(英国Syngene).

2 试验方法

2.1 微生物菌液的制备

从固体培养基挑取细菌并接种至10 mL液体LB培养基中，120 r/min、30 ℃振荡培养8～10 h，此时微生物处于对数生长期，将此菌液4 ℃保存，以供投加使用.

2.2 微生物菌液对废水的处理

2.2.1 单株菌液对废水的处理

将150 mL废水加入三角瓶中并加入单株菌液，菌液添加量为废水体积的5%和10%，120 r/min、30 ℃振荡培养120 h，每24 h取样，测定废水的色度，并用孔径为0.22 nm的滤膜过滤样品测定滤液CODCr.

2.2.2 混合菌液对废水的处理

将150 mL废水加入三角瓶中并加入混合菌液，设定4个菌液添加水平(1%、2%、5%、10%)，并在5%的投加量下改变反应条件(是否外加碳、氮源，是否曝气，改变废水的pH).120 r/min、30 ℃振荡培养120 h，每24 h取样，并用孔径为0.22 nm的滤膜过滤后测定滤液CODCr.

2.3 菌液强化污泥对废水的处理

将培养一周的活性污泥样品放置在有效容积为5 L的聚乙烯容器内进行好氧曝气培养，初始MLSS为5 000 mg/L.向活性污泥中加入废水并加入混合菌液，泥水比为1∶1.设计L9(34)的正交试验，试验中各项因素水平见表2所示.在保持溶解氧(DO)浓度约2 mg/L和25 ℃恒温条件下，连续培养48 h，分别在培养期的1 h，2 h，4h，6 h，8 h，12 h，24 h，48h等，取上清液测CODCr.

表2 正交试验因素水平

注：1.菌液投加时间为试验的0 h、12 h.水平1为0 h时1次投加，水平2为0 h、12 h时2次投加，水平3为12 h时1次投加.2.外加碳、氮源以COD=1 000 mg/L为基准.

CODCr的测定采用HJ/T399-2007法，色度的测定采用稀释倍数法，pH的测定采用仪器快速测定.

2.4 菌株分子生物学鉴定

为验证菌剂在处理过程中组成菌的存活情况，我们对直投法处理后的染料废水中进行平板分离，之后再对优势菌株进行基因组DNA提取(康为世纪，北京)，使用细菌通用引物对27F/1492R进行16S rRNA基因的扩增.

PCR体系为(25μL)：模版1μL，混合液12.5μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，无菌水9.5μL ddH2O，引物 (27F/1492R)各1μL.

PCR反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循环25次；72 ℃延伸1 min.

采用PCR产物回收试剂盒对扩增片段进行回收，在琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小后，将其TA克隆并测序，将测序后的16S rRNA基因序列结果与GenBank上的相关16S rRNA基因序列进行相似性比对分析[9,10].

3 结果与讨论

3.1 微生物菌液对废水的处理效果

3.1.1 单株菌液对废水的处理效果

图1显示了在不同投加量下添加单株菌液后废水COD的变化趋势.从图1可以看出，在添加菌液之后，废水的COD均有一定程度地下降.但值得注意的是，刚添加入菌液后的废水COD会上升，这可能是由于细菌刚进入新环境还需要适应，并未立即开始环境基质代谢而造成[11].总体来说，菌液投加量为5%时废水的COD可以降低至600 mg/L左右，其降低程度要好于投加量为10%的情况;在5%的投加量下,菌c和e两种菌的菌液对废水COD去除效果最好，其去除率均达到了50%左右.

(a)菌液添加量为5%

(b)菌液添加量为10%图1 不同添加量下添加单株菌液 后废水COD的变化

表3为投加量5%时单株菌液对废水色度的去除效果.可以明显看出，对COD去除效果较好的菌c和e，却是对色度去除最差的两株菌；而菌d虽不能很好地去除COD，但其对色度的去除率能达到80%.由以上试验可以看出，单株菌液并不能很好地起到既去除废水COD，又能去除废水色度的作用.因此，之后试验采用混合菌液对废水进行处理.

表3 单株菌液对废水色度的去除效果

3.1.2 混合菌液对废水的处理效果

混合菌液在不同状态下对废水COD的去除效果如图2所示.从图2(a)可以看出，混合菌液投加量的不同对废水COD的去除效果也不同.在5%这个投加量下,微生物菌液处理废水的效果最好，其对废水COD的去除率高于其它三个投加量.这是因为菌液投加量过低会造成废水中所含有的有效细菌数目过少，而少量的细菌并不能完全地利用废水，从而导致其对废水COD的去除效果不好.而在10%这个投加量下，由于废水中细菌的数目过多，导致细菌在利用废水生长的同时分泌出了一定量的代谢产物，造成废水COD降低的效果不好.

图2(b)显示的是在废水初始pH不同下，菌液对废水COD的去除效果.可以明显看出，在调节废水pH之后加入菌液时，当在pH=5的条件下对废水的处理效果最好；而在pH=7这个偏中性的环境下废水COD的降低效果并不好；在pH=9、11环境下的处理效果更差.由于组成复合菌剂的菌株是从降解染料的厌氧污泥中分离出来的，在酸性条件下生长更好，所以pH=5时处理效果好，再往上增加会导致微生物生长不利，从而使得处理效果不佳，COD去除有限[12].

图2(c)是在5%投加量下，通过改变反应条件的废水COD去除效果图.可以看出，无论是曝气还是对废水中外加碳源，其对废水COD降低的影响并不大；而对废水外加氮源，则能有效促进废水COD的去除.通过对废水理化性质观察可以发现，该毛皮染色废水的NH4+-N较低，而正常的微生物体内的碳氮比是5∶1[13]，这造成细菌在消耗废水中的C的同时可能无法消耗需要的N，从而导致细菌的生长并不是在一个最合适的碳、氮源条件下，因此对废水的去除效果也就不理想[14].

(a)不同混合菌液投加量

(b)菌液投加量为5%，不同废水起始pH值

(c)菌液投加量为5%，不同反应条件图2 不同状态下添加混合 菌液废水COD的变化

从上述试验结果看出，菌液在5%投加量下，废水初始pH=5，同时在废水中外加一定量的氮源，会对废水COD的去除起到很好的效果.只加入菌液的废水COD最低能降到500 mg/L左右，无法达到理想的效果，因此，宜将菌液投加入活性污泥中，使其混合，再对废水进行处理.

3.2 菌液与污泥混合对废水的处理效果

表4为菌液与污泥混合处理毛皮染色废水的正交试验结果.可以看出，Ri的排序为13.666>6.333>5>3.667，添加投加量对菌液处理废水的效果影响比较显著，进水pH对其处理效果影响最小.

表4 L9(34)正交试验结果

由正交试验结果可知，本试验最优组合为投加量5%(V/V)，0 h一次投加，外加营养物质C/N为5∶1，进水pH为5，其对废水的COD去除率可以达到90%以上.

由于添加了微生物菌液，在大多数试验组中废水COD去除率都达到了80%以上，而传统生化方式对废水COD的去除率最好也就达到80%，很难达到90%以上.因此，投加混合菌液对废水COD的去除具有积极效果.

3.3 复合菌剂的生物稳定性

通过对直投法处理液中的菌种进行分离鉴定，发现优势菌株和组成复合菌剂的菌株基本一致,见表5所示.说明在处理毛皮染色废水过程中,复合菌剂的生物性能稳定.这可能是因为复合菌剂的构成菌株通过共代谢稳定存在于废水的处理过程中.

实验表明，在废水处理中，假单胞菌属能较好地利用葡萄糖并产生乙酸等物质[15]；副球菌属是一类兼性厌氧的细菌，在好氧环境下扮演硝化细菌的角色，而在厌氧环境下却能促进反硝化作用，能够快速利用废水中的小分子有机酸进行生长[16]；复合菌剂中的寡养单胞菌具有独特的代谢活性，对于有机高分子和有机盐均有很高的利用度[17]，已有研究表明其对60 mg/L结晶紫溶液的脱色率达95.7%[18].从降解染色废水环境中,分离并筛选出几种对于染色废水具有高效降解效果的微生物,将是今后重点研究的方向之一.

表5 菌种鉴定结果：同源菌种及相似度

4 结论

从降解偶氮染料的厌氧污泥中分离纯化出6种微生物，再将微生物制备成为菌液，之后将其投加到毛皮染色废水中.试验结果表明：

(1)单株菌液对废水COD的去除效果存在差别.对废水COD去除效果较好的菌株，其对废水色度的去除效果不好.

(2)混合菌液对废水的处理效果表明，菌液投加量、废水初始pH、是否外加营养物质等对废水的COD去除具有一定的影响.

(3)向活性污泥中加入微生物菌液后，当菌液投加量5%(V/V)，0h一次投加，外加营养物质C/N为5∶1，进水pH为5时，其对废水COD的去除率可以达到90%以上.与普通生化法处理废水相比，其处理效果更好.

(4)通过对直投法处理液中的菌种进行分离鉴定，可以证实处理液中优势菌株和组成复合菌剂的菌株一致.说明在处理毛皮染色废水过程中，复合菌剂的生物性能稳定.

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