马纳维诺凝胶作为候选杀微生物剂的生物学活性和稳定性体外评价

李良峰，贲银银，李亮助，张晓燕,2

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，复旦大学生物医学研究院，上海 201508； 2. 复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032

据联合国人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征计划〔Joint United Nations Programme on human immunodeficiency virus(HIV)/acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)，UNAIDS〕的相关报道，截止2012年，全球共有3 530万例艾滋病患者。其中2012年新发HIV感染230万例，与2001年(340万例)相比，降低33%[1]。目前，性传播途径已成为HIV最主要的传播途径。在中国，HIV同性之间的传播比例越来越高。2007年HIV感染者中，同性之间传播比例为13%，比2006年的2.5%大幅度提高[2]。近年来，杀微生物剂的研究正从无特异性作用机制的广谱杀微生物剂慢慢向能特异性抑制HIV感染的杀微生物剂转变，如反转录酶抑制剂(reverse transcriptase inhibitor，RTI)[3,4]。最新临床研究表明，包含1%核苷酸类反转录酶抑制剂替诺福韦(tenofovir，TFV)的凝胶制剂经生殖道局部使用能很好地阻止HIV通过性途径传播[5]。马纳维诺(maraviroc，MRV)为趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5，CCR5)拮抗剂，通过屏蔽辅助受体CCR5来阻止HIV进入宿主CD4+T细胞[6,7]。马纳维诺作为口服药物在临床试验中取得了较好效果，如在Ⅲ期临床试验中，相对于安慰剂组，联合使用马纳维诺能显著增加CD4+细胞数量(P<0.001)，同时还能显著改善机体的免疫应答[8-10]。因此，马纳维诺作为候选杀微生物剂其有效性与安全性值得探索。羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose，HEC)广泛应用于生殖道制剂中，是一种较好的凝胶制剂载体[11]。本研究将马纳维诺溶于HEC中，在体外对其生物学活性进行评价，为其作为杀微生物剂使用提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马纳维诺购自上海百谊生物科技有限公司，HEC购自美国Sigma公司，DMEM/High glucose培养基和改良RPMI-1640培养基购自美国Thermo公司，新生牛血清购自美国Thermo公司，噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT)试剂盒购自美国Sigma公司，荧光素酶底物购自美国Promega公司。TZM-bl、Jurkat-T细胞系由本实验室培养。

1.2 仪器

Synergy 2多功能酶标仪购自美国BioTek公司，Victor 3多功能酶标仪购自德国PerkinElmer公司，CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司。

1.3 马纳维诺与HEC复合使用的安全性评价

采用TZM-bl和Jurkat-T细胞系。实验中马纳维诺浓度为100 mmol/L、10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L。分为两大组：一组马纳维诺溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，一组溶于0.015% HEC中。将细胞按1×104个/孔在96孔板中铺板，第2天将培养基换成含对应浓度马纳维诺的培养基，每个浓度设3个复孔，继续培养48 h；加入20 μl 15 mg/ml MTT，37 ℃、5%CO2孵育3～4 h；吸去上清液，加入200 μl二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，在振荡器上振荡10 min，于490 nm处读取光密度(optical density，OD)值。最终结果用细胞存活率来表示：细胞存活率=(实验孔OD值-本底OD值)/(空白对照孔OD值-本底OD值)×100%。与此同时，将各药物浓度组、阴性对照组(不加药物)的OD值及各药物浓度组相对于阴性对照组被抑制的OD值输入SPSS软件，进行回归分析，选取细胞存活抑制率为10%和50%时的药物浓度，即各种细胞90%存活和50%存活时的药物安全浓度。

1.4 马纳维诺与HEC复合使用的抗病毒活性检测

采用96孔板，每孔加入1×104个TZM-bl细胞、100半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose，TCID50)的B亚型和C亚型假病毒、对应浓度的马纳维诺和马纳维诺+HEC复合物，其中HEC最终浓度为0.015%，马纳维诺的浓度从25 nmol/L开始5倍梯度稀释，直至0.04 nmol/L。同时设只加假病毒的阳性对照和只有细胞的阴性对照，每孔中的体系为200 μl，每组设3个重复。37 ℃、5% CO2孵育48 h；吸去上清液，加入25 μl细胞裂解液，振荡器振荡10 min；加入50 μl荧光素酶底物液，在多功能酶标仪上读数，用SPSS软件计算对应的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.5 马纳维诺与HEC复合使用的稳定性检测

将马纳维诺溶于1.5% HEC中，终浓度为6 mmol/L，储存于4 ℃、室温、30 ℃和40 ℃，保持相对湿度为75%。储存前先检测复合物的抗病毒活性，然后每隔1周检测1次，持续8周。检测时将马纳维诺稀释至8 nmol/L(马纳维诺对C亚型假病毒的IC90)进行抗病毒活性检测，采用C亚型假病毒，检测步骤见1.4。

2 结果

2.1 马纳维诺与HEC复合使用的安全性评价

如图1所示，当马纳维诺浓度为100 mmol/L时，不管是溶于PBS还是HEC中，TZM-bl和Jurkat-T细胞几乎100%死亡；随着浓度不断降低，细胞存活率越来越高；当浓度降至10 μmol/L时，两种细胞的存活率接近100%。用SPSS软件可获得马纳维诺在PBS和HEC溶液中的IC50和IC90。对于Jurkat-T细胞，马纳维诺的IC50分别为77 μmol/L(PBS)和75 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分别为2 μmol/L(PBS)和2 μmol/L(HEC)(P>0.05)；而对于TZM-bl细胞系，马纳维诺的IC50分别为205 μmol/L(PBS)和201 μmol/L(HEC)(P>0.05)，IC90分别为17 μmol/L(PBS)和16 μmol/L(HEC)(P>0.05)。由此可见，HEC的加入并不影响马纳维诺的细胞毒性，对细胞安全性没有明显影响。

A: TZM-bl. B: Jurkat-T.

2.2 马纳维诺与HEC复合使用的抗病毒活性检测

采用B亚型和C亚型两种HIV假病毒来进行体外抗病毒活性检测。将马纳维诺分别溶于PBS和HEC中，从25 nmol/L起5倍梯度稀释至0.04 nmol/L。结果显示，当马纳维诺浓度为25 nmol/L时，不管是溶于PBS还是HEC，都几乎100%抑制病毒感染；随着浓度不断降低，抑制率也不断降低；降至0.04 nmol/L时，对假病毒感染几乎无抑制效果(图2)。对B亚型和C亚型假病毒，马纳维诺的IC50分别为1.383 nmol/L、1.799 nmol/L(PBS)，以及0.967 nmol/L、1.264 nmol/L(HEC)。结果提示，当马纳维诺与HEC复合使用时，HEC不但不抑制马纳维诺的抗病毒效果，反而有轻微增强作用。

A: B subtype. B: C subtype.

2.3 马纳维诺与HEC复合使用的稳定性检测

将马纳维诺溶于PBS和HEC后，分别置4 ℃、室温、30 ℃和40 ℃，每隔1周进行抗病毒活性检测。如表1所示，保存前其对C亚型假病毒的抗病毒效果均在90%以上；在开始阶段，抗病毒效果一直维持在90%左右；到第8周，其抗病毒效果仍处于90%以上。结果提示，马纳维诺不管是保存在PBS还是HEC中，都具有较好的稳定性。马纳维诺在HEC中长期保存对其抗病毒活性无明显影响。

表1 马纳维诺与HEC复合使用的稳定性评价Tab.1 Stability evaluation of combination of maraviroc and hydroxyethyl cellulose

3 讨论

HIV-1融合抑制剂在HIV-1生命周期初始阶段发挥作用，是较理想的候选杀微生物剂[12,13]。其在生殖道局部使用可很好地阻止HIV-1与靶细胞结合，从而抑制病毒感染[14,15]。本研究将马纳维诺与HEC混合，形成马纳维诺凝胶制剂，并对其生物学活性进行相关评价。结果显示，马纳维诺凝胶对B亚型和C亚型假病毒具有较好抑制效果，且HEC不但没有抑制马纳维诺的抗病毒活性，反而在一定程度上使其活性稍微增强，同时没有加剧其细胞毒性。此外，马纳维诺凝胶的抗病毒活性具有很好的稳定性，即使在高于人体正常体温的40 ℃，持续8周，抗病毒活性也没有明显降低，说明该凝胶可在人体内长时间停留，并保持较高的抗病毒活性。这些结果提示马纳维诺凝胶有可能作为杀微生物剂来抑制HIV传播，同时也为动物水平的评价及临床试验提供了一定的理论基础。

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