γ干扰素释放试验在儿童肺结核诊断中的价值

鲍磊，李涛，卢水华，张文宏

1. 复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040； 2. 上海市公共卫生临床中心，上海 201508

Keywords: Child; Pulmonary tuberculosis; Interferon γ release assay

结核病是威胁人类健康的主要传染病之一。据统计，全球约1/3人口受结核分枝杆菌感染。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2013年报道，2012年全球仍有860万新发病例，其中53万例为儿童[1]。中国尽管有较高的卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)接种率，但每年仍有100万左右新发病例。因此，准确诊断结核病并规范治疗，对控制结核病的流行非常重要。

结核病的诊断较复杂，由于结核分枝杆菌与BCG及环境中其他非结核分枝杆菌存在交叉反应，过去100多年广泛使用的结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test, TST)在中国这样的BCG高接种地区使用价值有限[2,3]。γ干扰素释放试验(interferon γ release assay, IGRA)是近10年来发展的新型结核病诊断手段。与TST使用的纯化蛋白衍生物不同，IGRA使用的2种抗原是由结核分枝杆菌特有的基因序列RD1编码产生，包括6 kDa早期分泌抗原靶分子(early secreted antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)和培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)。体外使用这2种抗原刺激机体特异性T细胞，产生并释放γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)，检测释放的IFN-γ可辅助结核病诊断。由于RD1只存在于结核分枝杆菌的基因序列中，假阳性结果减少，因此IGRA较传统TST具有更高的特异度[4]。

目前IGRA商用试剂盒有2种：QuantiFERON-Gold In-Tube(QFT-GIT)和T-SPOT.TB。前者主要通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的IFN-γ浓度，后者通过酶联免疫斑点(enzyme-linked immunospot，ELISPOT)检测抗原刺激后产IFN-γ的T细胞数。与T-SPOT.TB相比，QFT-GIT不需分离外周血单核细胞，操作更简单方便。这2项检测方法用于结核病诊断，主要集中在经济发达的低发病率国家，在结核病高发地区尤其是在儿童中的使用较少[5,6]。有报道显示，在欧洲结核病低发国家，与传统TST相比，IGRA在儿童结核病诊断中并无明显优势[7,8]。中国作为结核病高发地区，有较高的BCG接种率，本研究主要探讨QFT-GIT和T-SPOT.TB在这一地区儿童肺结核诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2010年12月～2011年8月就诊于上海市公共卫生临床中心和复旦大学附属儿科医院，具有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等症状，伴或不伴发热、盗汗、消瘦、乏力等全身表现，临床怀疑肺结核的16岁以下患儿共45例，抽取静脉血行QFT-GIT检测。选取2012年4月～2012年12月就诊于上海市公共卫生临床中心，同样具有上述临床表现的16岁以下患儿共69例，抽取静脉血行T-SPOT.TB检测。所有入组患儿的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)检测均为阴性，均接种过BCG。检测结果不影响临床治疗方案的制订。收集每例患儿的基本信息、临床表现、实验室检查结果、影像学资料、病理报告、治疗方案等相关信息，根据表1的分类标准进行诊断和分类[9]。

1.2 QFT-GIT和T-SPOT.TB

QFT-GIT试剂盒(澳大利亚Cellestis公司)包括阴性对照管、阳性对照管﹝(包被植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)﹞及TB抗原管(分别包被ESAT-6、CFP-10、TB7.7)。首先，每个采血管各收集1 ml全血，摇晃混匀后于37 ℃培养箱培养16～24 h，离心并收集上清液。ELISA检测上清液中的IFN-γ浓度。TB抗原管中的IFN-γ浓度减去阴性对照管中的IFN-γ浓度作为结核分枝杆菌特异性抗原刺激机体产生的IFN-γ量。当该差值≥0.35 IU/ml且≥25%阴性对照管数值，结果判为阳性。差值<0.35 IU/ml或≥0.35 IU/ml但<25%阴性对照管，同时阳性对照管减去阴性对照管≥0.5 IU/ml，结果判为阴性。差值<0.35 IU/ml或≥0.35 IU/ml但<25%阴性对照管，同时阳性对照管减去阴性对照管<0.5 IU/ml；或阴性对照管>8.0 IU/ml，为结果不确定。

T-SPOT.TB(英国Oxford Immunotec公司)主要通过ELISPOT检测ESAT-6和CFP-10刺激后产IFN-γ的T细胞数。采集外周血后，分离外周血单核细胞，调整细胞数为2.5×105，分别加入空白对照孔、抗原A(ESAT-6)孔、抗原B(CFP-10)孔和阳性对照(PHA)孔，37 ℃孵育16～20 h后读数。当空白对照孔计数≤5，且抗原A或抗原B孔计数减去空白对照孔的数值 > 6； 或当空白对照孔计数>5个，且抗原A或抗原B孔计数至少为空白对照孔计数2倍时，结果为阳性(图1)。

1.3 统计方法

将确诊肺结核和高度怀疑肺结核组的患者作为肺结核患者，排除肺结核组的患者作为非结核患者，疑似肺结核组因最终诊断不明确，未纳入数据分析。计算QFT-GIT和T-SPOT.TB的灵敏度、特异度、阳性预测值(positive predictive value，PPV)、阴性预测值(negative predictive value，NPV)、阳性似然比、阴性似然比，其中QFT-GIT检测的不确定结果纳入灵敏度和特异度计算。卡方检验用于比较QFT-GIT与T-SPOT.TB诊断儿童肺结核的差异，P<0.05为有统计学差异。所有统计均用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0软件进行。

2 结果

2.1 基本信息

45例临床怀疑肺结核的患儿行QFT-GIT检测，69例行T-SPOT.TB检测。收集相关信息后，根据表1的诊断分类标准， 分为4个组。其中3例

图1 T-SPOT.TB 操作示意图Fig.1 Operation chart of T-SPOT.TB

表1 肺结核诊断分类标准Tab.1 Diagnostic classification of pulmonary tuberculosis

QFT-GIT检测和6例T-SPOT.TB检测的患儿，因归入疑似肺结核组， 故未纳入最后统计分析。其余105例患儿中，41例为确诊肺结核，其中21例行QFT-GIT检测、20例行T-SPOT.TB检测；32例为高度怀疑肺结核，其中5例行QFT-GIT检测、27例行T-SPOT.TB检测；32例排除肺结核的儿童，16例行QFT-GIT检测，16例行T-SPOT.TB检测(图2)。每组儿童年龄、性别、临床症状、影像学表现、BCG接种情况、治疗药物等相关信息见表2。

2.2 QFT-GIT和T-SPOT.TB的检测结果

确诊肺结核的41例患儿中，18例QFT-GIT检测阳性，14例T-SPOT.TB检测阳性；高度怀疑肺结核组中，4例QFT-GIT检测阳性，20例T-SPOT.TB检测阳性。这两组中的QFT-GIT和T-SPOT.TB检测阳性率均达70%以上。排除肺结核的儿童中，2例QFT-GIT检测阳性，1例QFT-GIT检测结果不确定，1例T-SPOT.TB检测阳性。具体结果见表3。

PTB, pulmonary tuberculosis.

表2 入组儿童基本信息Tab.2 Demographic and clinical information of recruited children

表3 QFT-GIT和T-SPOT.TB检测结果Tab.3 Results of QFT-GIT and T-SPOT.TB

2.3 QFT-GIT和T-SPOT.TB的诊断价值

比较这2种方法的灵敏度、特异度、PPV、NPV、阳性似然比和阴性似然比，结果显示QFT-GIT用于诊断儿童肺结核的灵敏度为84.6%(95% CI 为65.9%～94.5%)，特异度为81.3%(95% CI为52.6%～94.2%)；与QFT-GIT比较，T-SPOT.TB的灵敏度低(72.3%，95% CI 为58.1%～83.2%)，特异度高(93.7%，95% CI为69.7%～99.9%)。2种检测方法的PPV均达90%以上(91.7%vs. 97.1%)(表 4)。此外，11例QFT-GIT检测和5 例 T-SPOT.TB检测的患儿在IGRA检测前1个月内接受过激素治疗(1 mg·kg-1·d-1)。比较使用激素与未使用激素的儿童，发现激素治疗后27.3%(3/11)患儿QFT-GIT结果阴性，其阳性率较未治疗组降低(72.7%vs. 93.3%)； 40.0%(2/5)患儿T-SPOT.TB结果阴性，假阴性率较未治疗者增加(40.0%vs. 26.2%)。

表4 QFT-GIT和T-SPOT.TB在儿童肺结核中的诊断价值Tab.4 Diagnostic value of QFT-GIT and T-SPOT.TB in childhood pulmonary tuberculosis

3 讨论

结核分枝杆菌涂片和培养阳性是结核病诊断的金标准[10]，但结核分枝杆菌培养至少需2周才能获得阳性结果，而约50%培养阳性患者的涂片结果为阴性[11]。因此，开发更准确、更快速的诊断方法对提高结核病的早期诊断率有重要意义。2001年，QuantiFERON-TB被美国食品药品管理局(Food and Drug Administrator，FDA)批准用于结核分枝杆菌感染的辅助诊断后，越来越多的研究将目光投向该领域[12]。目前关于IGRA在结核病中的应用多集中于发达国家的成人中，在儿童中的研究较少。

本研究结果显示，QFT-GIT用于诊断儿童肺结核的灵敏度较T-SPOT.TB高(84.6%vs. 72.3%)，而T-SPOT.TB的特异度则比QFT-GIT高(93.7%vs. 81.3%)。2种检测方法的PPV均超过90%(91.7%vs. 97.1%)。浙江省成人肺结核诊断研究显示，IGRA的PPV为88.2%[13]。由于潜伏性结核的感染比例随年龄增长而逐渐增加，因此儿童中IGRA更少受潜伏性结核感染的影响。本研究显示， 2种IGRA检测方法诊断儿童肺结核的PPV均较成人高。T-SPOT.TB的阳性似然比高达11.5，与QFT-GIT相比，更适合于儿童肺结核的诊断。

激素有抑制机体免疫反应的作用，长期以来人们一直认为其对IGRA结果存在负面影响，但有关报道较少[14]。本研究中，11例QFT-GIT检测和5例T-SPOT.TB检测患儿在IGRA检测前1个月内接受过激素治疗，2种检测的假阴性率分别增加至27.3%和40.0%。尽管这一差异没有统计学意义，但提示激素治疗会导致假阴性结果。因此，建议一旦怀疑结核分枝杆菌感染，应在使用激素前尽早行IGRA检测。受样本量的限制，本研究结果可能有一定的偏倚，故需扩大样本量以证实这一结论。

综上所述，QFT-GIT和T-SPOT.TB在中国这一BCG高接种、结核病高发地区用于儿童肺结核诊断的PPV较高，具有较高的肺结核辅助诊断价值。

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