阿德福韦酯对慢性乙型肝炎患者血清IFN-γ、IL-10、 乙型肝炎病毒DNA水平及肝组织病理的影响

石文波，盛慧萍，杨 岩，张小亚，王国宁

(1.宁夏医科大学，宁夏银川 750004；2.宁夏医科大学总医院感染疾病科，宁夏银川 750004； 3.宁夏医科大学总医院重症监护医学科，宁夏银川 750004)

乙肝患者病情转归主要取决于乙肝病毒及机体自身免疫力两个方面的影响，慢性乙型肝炎(CHB)治疗原则中抗病毒治疗是关键。有研究表明，核苷(酸)类似物抗病毒的同时，也能影响慢性乙肝患者的免疫功能[1]。目前，多数学者认为这种作用与抗病毒治疗引起的病毒载量下降，从而机体相应免疫系统得到恢复有关。阿德福韦酯为腺嘌呤核苷类似物，对乙肝病毒复制有明显的抑制作用，在体内细胞激酶作用下磷酸化为活性代谢产物二磷酸盐，与酶的自然底物三磷酸脱氧腺苷竞争抑制乙型肝炎病毒DNA聚合酶，或通过整合到病毒DNA链后使其复制终止，但对慢乙肝患者免疫水平特别是细胞因子的影响机制还不十分清楚。本研究通过观察阿德福韦酯(adefovir dipivoxil, ADV)对慢性乙肝患者外周血细胞因子IFN-γ、IL-10、乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV DNA)水平及肝组织病理的影响，探讨ADV对慢性乙肝患者免疫水平及肝组织病理的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料选取宁夏医科大学总医院感染性疾病科门诊和住院部2007～2009年收治的18例慢性乙肝患者，均符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准[2]，同时达到抗病毒治疗条件，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎和其他原因所致肝损害及心、脑、肺等疾病患者。18例中男16例，女2例，年龄19～52(30.45±7.50)岁，所有患者治疗前未使用过抗病毒药物和免疫调节剂。18例患者均接受天津药物研究所有限公司生产的ADV(代丁)，每天10 mg，口服48周，患者依从性好。20名健康体检者作对照，其肝功指标均在正常范围，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒标志物均为阴性。

1.2检测方法所有患者均为清晨空服抽取肘静脉血10 mL，在6 h内离心取上层血清，一部分放入2 mL EP管中，存放于零下70 ℃冰箱待检细胞因子IFN-γ及IL-10；一部分用于肝功及HBV DNA检测。细胞因子检测用ELISA方法，试剂盒购自美国ADL公司天津分公司，严格按产品说明书进行操作。HBV DNA检测采用实时荧光定量PCR法，PCR检测试剂盒购自中山医科大学达安基因诊断中心。肝组织用G16快速穿刺针抽取，每条肝组织长度均在1.5 cm以上，肝组织采用HE染色、Masson染色、网染、VG染色，参照《慢性乙型肝炎防治指南》中分期标准[2]，由病理科专家作出肝组织炎症分级及纤维化分期。

2 结 果

2.1慢性乙肝患者丙氨酸氨基转移酶、血清HBVDNA指标治疗前后的比较慢性乙肝患者治疗后丙氨酸氨基转移酶(alanine amino transferase, ALT)、血清HBV DNA指标均较治疗前明显好转，各自比较差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2慢性乙肝患者治疗前后肝组织学的改变治疗后肝组织炎症活动度较治疗前明显降低，其中有12例较前明显减轻，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；肝组织纤维化程度较治疗前有所改善，其中有6例改善明显，两组比较差异无统计学意义(P>0.05，表2)。另附1例患者经治疗后其肝组织炎症及纤维化明显改善图片(图1)。

表1慢性乙肝患者治疗前后ALT、HBVDNA水平的比较

Tab.1 Comparison of ALT and HBV DNA levels before and after ADV treatment in CHB patients

组 别例数ALT(IU/L)HBV DNA(lgIU/mL)治疗前18180.08±175.396.13±1.20治疗后1833.95±16.37*2.64±0.71*

与治疗前比较，*P<0.05；ALT：丙氨酸氨基转移酶；HBV DNA：乙型肝炎病毒DNA。

图1病例巴某ADV治疗前后肝脏病理学的改变

Fig.1 Changes of liver pathology before and after ADV treatment (HE, ×100)

A：巴某治疗前病理诊断为G3S2；B：巴某治疗后病理诊断为G1S0。

表2ADV治疗前后肝脏组织炎症及纤维化程度的变化

Tab.2 Changes of liver tissue inflammation and fibrosis before and after ADV treatment

组别例数炎症活动度(G)G0G1G2G3G4纤维化程度(S)S0S1S2S3S4治疗前1803654001413治疗后1826730033210

治疗前后炎症活动度(G)通过秩和检验，得到统计量P<0.05，故认为治疗前后肝组织炎症活动度变化差异有统计学意义。治疗前后纤维化程度(S)通过秩和检验，得到统计量P>0.05，故认为治疗前后肝组织纤维化分级差异无统计学意义。

2.3慢性乙肝患者治疗前后血清IFN-γ、IL-10水平的变化治疗前血清细胞因子IFN-γ、IL-10水平均较正常对照组低，差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗48周后血清细胞因子IFN-γ、IL-10水平较治疗前均有升高，差异均有统计学意义(P<0.05))。治疗后与正常对照组比较，IFN-γ水平仍低，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后IL-10水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3慢性乙肝患者在治疗前后IL-10、IFN-γ水平的比较

Tab.3 Expressions of cytokines IL-10 and IFN-γ in the control group and pre-treatment and post-treatment groups

组 别例数IL-10(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)对照组2023.06±7.2089.90±10.20治疗前189.50±2.40△32.60±8.20△治疗后1819.46±6.07*54.70±8.25*△

与对照组比较，△P<0.05；与治疗前比较，*P<0.05。

2.4治疗前肝组织炎症活动度高组(G≥3级)与炎症活动度低组(G≤2级)治疗后疗效观察治疗前慢性乙肝患者肝组织炎症活动度高组(G≥3级)与炎症活动度低组(G≤2级)经治疗48周后，观察IFN-γ及血清HBV DNA等指标，两组治疗前IFN-γ水平比较差异无统计学意义(P>0.05 )，治疗后前组IFN-γ水平升高较后组明显，差别有统计学意义(P<0.05)。前组血清HBV DNA只有1例未转阴，该例血清HBV DNA下降幅度>2 lgIU/mL,而后组有4例血清HBV DNA未转阴，HBV DNA下降幅度<2 lgIU/mL，该4例中有2例血清HBV DNA较治疗前更高。前组血清HBV DNA转阴率明显高于后组，但两者比较差异无统计学意义(P>0.05)，考虑可能与样本例数太少有关(表4)。

表4慢性乙肝患者肝组织炎症活动度高组(G≥3级)与炎症活动度低组(G≤2级)治疗前后IFN-γ及治疗后血清HBVDNA转阴例数、转阴率的比较

Tab.4 Expression of cytokine IFN-γ and changes of HBV DNA before and after treatment in the two groups with different degree of liver tissue inflammation

组 别例数IFN-γ(pg/mL)治疗前治疗后HBV DNA转阴例数转阴率(%)炎症高组933.55±11.2560.12±10.05△888.89炎症低组931.06±10.0342.69±7.80555.56

与炎症活动度低组比较，△P<0.05；HBV DNA：乙型肝炎病毒DNA。

3 讨 论

目前，普遍认为Th1/Th2细胞失衡是慢性感染发生和持续的原因之一[3]，Th1/Th2细胞失衡从而有相应细胞因子失衡。阿德福韦酯可明显抑制HBV DNA的复制，促进乙肝患者血清转氨酶正常化，促进肝脏组织学改善等功能。本研究结果也表现出阿德福韦酯具有上述功能。这里值得特别指出的是本研究中治疗前后肝组织纤维化改善程度上无统计学意义，也许与样本中病例治疗前纤维化程度已经明显偏高，且治疗时间不够长有关，还有待更长时间观察。早在1994年，CALI等[4]发现阿德福韦酯能显著增加C57BL/6大鼠的NK细胞活性和IFN-γ的分泌，抑制IL-1、IL-2的产生，从而推测阿德福韦酯可能还有免疫调理作用。后来STOOP等[5]发现阿德福韦酯降低乙肝病毒载量的同时，HBV核心抗原特异的IFN-γ有产生和增殖，而IL-10在治疗中没有降低。因此，有较多学者认为阿德福韦酯治疗后患者血清细胞因子变化是体内大量HBV被抑制后免疫系统恢复或增强的表现。近来范文博等[1]认为可能的机制为：①树突状细胞(dendritic cell, DC)作为目前已知机体内最大的抗原提呈细胞，在固有免疫与特异性免疫中发挥非常重要的作用。慢性乙肝患者DC功能损伤是造成免疫反应低下、HBV持续感染的重要原因之一[6]。抗病毒治疗可能同时抑制受感染DC中HBV，使DC的功能得以恢复，激活诱导Th1型细胞。②程序性死亡受体-1(PD-1)为存在T淋巴细胞膜上的一段跨膜蛋白，PD-1与其配体PD-Ligand1(PD-L1)通路能抑制HBV感染中抗原特异性T淋巴细胞的表达，抗病毒治疗可通过有效抑制病毒使PD-1的表达水平下降，并能阻断PD-1/PD-L1通路，促进T淋巴细胞功能的恢复[7]。③调节性T细胞(regulatory T cell, Treg细胞)是近来发现的具有强有力免疫负调节作用的T淋巴细胞的重要类型之一，可通过不同的途径抑制细胞免疫；STOOP等[8]发现外周血病毒载量高的慢性乙肝患者，其Treg细胞水平也相应的增高，抗病毒治疗可以降低Treg水平，并且增强机体抗病毒免疫应答。本研究发现慢性乙肝患者服用ADV治疗48周，其IFN-γ，IL-10水平较治疗前均升高，免疫水平有恢复，有利于机体清除病毒，但治疗后细胞因子水平仍不能恢复到对照组水平。在研究中还观察到治疗前肝组织炎症活动度高组(G≥3级)治疗效果较低组(G≤2级)更好，体现在治疗后患者IFN-γ升高幅度更大，且前者血清HBV-DNA转阴率高，病毒下降幅度大，这一点可以说明在免疫清除期及再激活期抗病毒治疗效果更好，而在免疫耐受期及非活动期治疗效果差，所以抗病毒的时机很重要。抗病毒是治疗慢性HBV感染的关键手段，机体清除HBV的关键是健全的特异性细胞免疫功能，抗病毒治疗可强化机体的清除病毒能力。阿德福韦酯是如何具体通过上述途径来增强或恢复机体抗HBV的免疫力还有待进一步的研究。

参考文献：

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[5] STOOP JN, VAN DER MOLEN RG, BAAN CC, et al. Regulatory T cell contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Hepatology, 2005, 41(4):771-778.

[6] ARIMA S, AKBAR SM, MICHITAKA K, et al. Impaired function of antigen-presenting dendritic cells in patients with chronic hepatitis B: localization of HBV DNA and HBV RNA in blood DC by in situ hybridization[J]. Int J Mol Med, 2003, 11(2):169-174.

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[8] STOOP JN, VAN DER MOLEN RG, KUIPERS EJ, et al. Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral immune response in chronic hepatitis B[J]. Virology, 2007, 361(1):141-148.