Hcy及其代谢酶MTHFR C677T基因多态性 与新疆汉族原发性高血压的相关性研究

杨 芳，蔡伟娟，胡 娜，宋 雪，王绍亮，程 江

(1. 石河子大学医学院生物化学教研室，新疆石河子 832000；2. 石河子大学新疆地方与民族高发病 教育部重点实验室，新疆石河子 832000；3. 石河子大学医学院第一附属医院检验科，新疆石河子 832000)

原发性高血压(essential hypertension, EH)是人类最常见的心血管疾病之一，其发病率及死亡率逐年上升，且呈现年轻化趋势。近些年，大量研究表明高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)是心脑血管疾病发生的独立危险因素[1]。Hcy及其代谢过程中相关代谢酶的基因多态性与EH的关系日益受到人们的重视，其结论尚存在分歧。影响人体内Hcy水平升高的原因很多，如种族、性别、营养与遗传等因素，主要为遗传因素。Hcy代谢途径中有四个关键代谢酶，而N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofotate reductase, MTHFR)是Hcy再甲基化代谢途径中的常见关键酶，其中碱基突变多为C677T位点。Hcy及其代谢酶MTHFR C677T基因多态性与新疆汉族EH的研究少见报道，因此值得进一步关注。

1 资料与方法

1.1研究对象①EH组：来自2012年5月至2013年3月新疆石河子大学医学院第一附属医院的EH住院治疗的EH患者200例，男88例，女112例，年龄29～73周岁，平均年龄(47.01±8.06)岁；入选标准符合WHO/ISH高血压诊断标准[2]，并排除继发性高血压，心肌病，糖尿病等患者。②NT组：随机抽取同期来我院的健康体检者200例，其中男93例，女107例，年龄26～68周岁，平均年龄(45.23±9.88)岁；入选标准：收缩压<140 mmHg和舒张压<90 mmHg者，无服用降压药物，无高血压家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病等病史。所有研究对象均来自新疆石河子地区无血缘关系的汉族人群，且在本地居住5年以上。

1.2标本收集抽取空腹12～14 h肘静脉血4 mL。一管用EDTA抗凝，混匀-80 ℃保存，供提取基因组DNA使用；另一管肝素抗凝，1 h内以3 000 r/min离心10 min，分离血浆供生化指标检测。

1.3Hcy水平检测采用AU2700生化分析仪通过酶法来测定Hcy含量(北京九强生物提供)。由我院检验科操作，并参加了2013年全国Hcy检测质控。

1.4生化指标检测采用罗氏P-800生化分析仪测定尿素、肌酐、尿酸、GLU、TG、TC、HDL-C、LDL-C、apo A、apo B和Lpa，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.5MTHFRC677T基因分型

1.5.1人外周血白细胞提取DNA EDTA抗凝血300 μL，使用血液基因组DNA小量抽提试剂盒法(北京天根生物提供)提取DNA，按说明书进行操作，提取后的DNA保存于-20 ℃。

1.5.2引物设计与合成 聚合酶链反应(PCR)引物序列参考有关文献[3]设计，序列为上游引物：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′(上海生工生物合成)。

1.5.3PCR扩增 反应体系为25 μL，包括模板DNA 3.0 μL，上下游引物(10 μmol)各0.5 μL，PCR master mix 12.5 μL(上海生工生物提供)和ddH2O 8.5 μL。应用德国Biometra PCR梯度基因扩增仪进行扩增。先95 ℃预变性5 min，95 ℃变性60 s，59 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，36个循环。循环完毕，72 ℃再延伸5 min。取PCR产物5 μL，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5.4HinfⅠ内切酶酶切分型 反应体系为32 μL，包括PCR产物10 μL，HinfⅠ内切酶(Fermentas公司提供)2 μL，10×Buffer R 2 μL和ddH2O 18 μL。37 ℃消化过夜，酶切反应终止后，其产物用90 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，室温恒压100 V电泳9 min，最后硝酸银染色35 min。在凝胶成像仪下观察并照相，进行基因分型。

1.6PCR产物基因测序随机选取不同基因型的PCR产物，送至北京博迈德公司测序分析，验证电泳结果。

1.7统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以频数表示，组间比较采用卡方检验；采用Hardy-Weinberg平衡法检测样本是否有群体代表性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1新疆汉族EH组和NT组的一般临床资料的比较在年龄、尿素、肌酐、尿酸、GLU、HDL-C、apo A、apo B和Lpa比较时，新疆汉族EH组与NT组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而EH组患者的收缩压、舒张压、体重指数、TG、TC和LDL-C均明显高于NT组，差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。

表1EH组和NT组的一般临床资料的比较

Tab.1 Comparison of the general clinical data between EH group and control group

项 目EH组(200例)NT组(200例)t值P值年龄(岁)47.01±8.0645.23±9.881.9580.051收缩压(mmHg) 152.38±9.60115.51±12.1833.605<0.001舒张压(mmHg)101.82±10.1576.34±8.5027.213<0.001体重指数(kg/m2)27.07±2.5024.23±1.6813.283<0.001尿素(mmol/L)5.03±1.514.86±1.181.2770.202肌酐(μmol/L)73.13±16.2272.32±13.750.5380.591尿酸(μmol/L)280.70±90.55272.72±69.370.9890.323GLU(mmol/L)5.31±1.095.21±0.840.9660.335TG(mmol/L)1.45±0.850.97±0.466.923<0.001TC(mmol/L)4.71±1.124.09±0.536.981<0.001HDL-C(mmol/L)1.24±0.401.19±0.211.4770.141LDL-C(mmol/L)2.83±0.842.45±0.525.263<0.001apo A(mmol/L)1.42±0.341.37±0.271.5800.115apo B(mmol/L)0.96±0.280.94±0.220.8380.403Lpa(mmol/L)217.07±179.23199.71±75.591.2620.208

2.2两组Hcy水平的比较①新疆汉族人群中不同性别Hcy水平的检测。在EH组中，男性Hcy水平(17.01±7.93)μmol/L高于女性(15.29±7.27)μmol/L，但差异无统计学意义。在NT组中，男性Hcy水平(10.56±1.93)μmol/L高于女性(10.13±2.12)μmol/L，亦无统计学意义(P>0.05)。②NT组与EH组Hcy的检测。两组Hcy水平的比较，EH组Hcy水平(16.05±7.59)μmol/L显著高于NT组(10.33±2.04)μmol/L，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3基因PCR检测及基因型鉴定的结果PCR扩增后得到198 bp的片段(图1)。经HinfⅠ内切酶酶切，37 ℃过夜消化，再经90 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后，成像仪下得到三种基因型：野生CC基因型为一个198 bp的片段，凝胶成像仪下见一个198 bp条带；杂合突变CT基因型，即酶切后产生的198 bp片段、175 bp和23 bp片段三个片段，成像仪下可见198 bp和175 bp的两个条带；纯合突变TT基因型，即酶切后产生的175 bp和23 bp两个片段，成像仪下仅见一个175 bp的条带(图2)。

图1PCR扩增图

Fig.1 Polymerase chain reaction amplification

M：Marker；1～6：泳带PCR扩增片段均为198 bp。

2.4PCR产物碱基序列测序结果MTHFR C677T基因位点的三种基因型碱基测序结果与电泳结果一致 (图3)。

图2RFLP酶切图

Fig.2 Polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism enzyme

M：Marker；2、3：CC型；4、5：CT型；1、6：TT型。

图3PCR产物碱基序列测序图

Fig.3 Sequencing of the PCR products base

A：纯合突变TT型；B：野生型CC型； C：杂合突变CT型。

2.5Hardy-Weinberg平衡检验对400例新疆汉族人群MTHFR C677T基因型进行Hardy-Weinberg平衡检

验，结果显示两组基因型均符合遗传平衡定律(EH组χ2=1.794，P=0.408；NT组χ2=1.566，P=0.457)，说明在遗传学上具有较好的群体代表性。

2.6EH组与NT组MTHFRC677T多态性基因型和等位基因分布情况两组C677T位点经检测后均有CC、CT和TT 3种基因型。EH组3基因型频率分别为19.5%、49.5%和31.0%，C和T等位基因频率分别为44.25%和55.75%。NT组3基因型频率分别为30.5%、44.5%和25.0%，C和T等位基因频率分别为52.75%和47.25%。两组中3种基因型总体分布频率差异有统计学意义(P<0.05)；EH组中TT型基因频率及T等位基因频率均高于NT组中TT型基因频率及T等位基因频率，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.7MTHFRC677T位点基因型与Hcy水平的关系在新疆汉族原发性高血压人群中，MTHFR C677T多态位点CC型的Hcy水平(13.12±6.53)μmol/L与CT型Hcy水平(17.17±8.25)μmol/L比较，发现有显著性差异(P<0.05)；CC型的Hcy水平(13.12±6.53)μmol/L与TT型Hcy水平(16.12±6.69)μmol/L比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2EH组与NT组C677T多态性基因型及等位基因的分布情况

Tab.2 Comparison of C677T polymorphism genotype and allele distribution between EH group and control group [n(%)]

3 讨 论

Hcy是人体中甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程的中间产物。Hcy的升高可通过上调血管内皮细胞中Fas分子，使血浆NO减少，内皮素-1增多，造成血管内皮细胞功能紊乱[4]；通过内质网应激增加caspase-3的活性诱导凋亡祖细胞致动脉硬化，血管平滑肌增生[5]。大量研究显示，Hcy水平的升高与原发性高血压有着密切的联系。1988年至1994年第三次国际健康和营养研究[6]显示，Hcy每增高5 μmol/L，男性舒张压和收缩压分别增长0.5 mmHg和0.7 mmHg，女性的分别增长0.7 mmHg和1.2 mmHg。本研究表明在EH组和NT组中，男性Hcy水平均高于女性，但无明显差异；同时EH患者Hcy水平均显著高于NT组，提示Hcy水平与EH有一定联系，与张四文[7]报道一致。

MTHFR基因多态性是影响Hcy代谢的关键酶，其基因677位碱基的突变使编码后的丙氨酸被缬氨酸取代，使代谢酶的活性及耐热性降低，进而影响Hcy 的再甲基化，人体中Hcy在血液中堆积，产生高同型半胱氨血症[8]。本研究通过对Hcy水平与MTHFR基因C677T 3种基因型间的分析发现CT、TT型人群中Hcy水平较CC型高。我们认为C677T的多态性与Hcy水平有一定的相关性。研究表明，不同人群MTHFR基因C677T位点碱基的突变频率分布存着差异。有学者报道宁夏回族EH人群TT基因型和T等位基因频率为22.6%和42.8%[9]，河南汉族EH人群分别为12.3%和29.9%[10]。国外土耳其EH人TT基因型和T等位基因频率为12.8%和33.3%[11]。本研究结果发现，对于MTHFR代谢酶基因多态性最常见的突变C677T位点进行筛选后发现，新疆石河子地区汉族EH人群TT基因型频率为31.0%，T等位基因频数为55.75%，此研究略高以上地区，接近于宁夏回族EH人群。而健康人群中C677T基因突变频率在国内外也有不同报道，ME等[12]研究马来西亚人群TT型突变频率约为6.3%、澳大利亚白人为8.9%[13]。2010年ZHANG[14]等研究发现广西瑶族人群TT基因和T等位基因频率分别为4%和22.6%，而汉族人群分别为11%和39.1%。2013年YANG等[15]对国内15 357例成年汉族人群进行调查，发现在南方海南地区纯合突变频率最低，T等位基因和TT基因频率分别为24.0%和6.4%；而北方山东地区突变频率最高，T等位基因和TT基因频率分别为63.1%和40.8%。本研究发现新疆石河子地区汉族健康人群TT型突变频率为25%，与王丽娜等[16]对新疆汉族人群的研究结果接近。

目前，MTHFR C677T基因多态性与高血压的关系在国内外报道结果不尽一致。国外FOWDAR等[13]对澳大利亚白人进行研究，发现EH组和NT组的T等位基因频率为31.8%和32.2%，揭示高血压与MTHFR C677T基因多态性无关。LWIN等[17]研究发现日本男性MTHFR基因C677T多态性与血尿酸水平有关，与高血压无关。但是，ABDULLAH等[18]研究沙特阿拉伯地区发现健康组、高血压伴有肥胖组和高血压伴糖尿病组突变基因频率(TT+CT)分别为26%、40.7%和39.6%，两组高血压组均明显高于健康组，提示T等位基因可能为高血压的风险因子。2009年基因组[19]对18 738例白种健康女性52种可能与高血压有关的77个易变异基因进行检测，发现MTHFR基因C677T基因突变与高血压的发生有关。国内宗永华等[20]发现安徽地区EH人群MTHFR C677T基因纯合突变可能是Hcy升高和H型高血压发病的重要遗传因素，且存在性别差异。本课题研究结果显示：EH组和NT组C677T 3种基因型(CC、CT、TT)的分布频率分别为19.5%、51.5%、31%和30.5%、44.5%、25%；两组等位基因C和T的分布频率分别为44.25%、55.75%和52.75%、47.25%。两组中的3种基因型的总体分布频率存在差异(P<0.05)，且基因型分布特征以CT杂合子基因型最多；其中EH组的MTHFR基因突变TT基因型频率及T等位基因频率均高于NT组(P<0.05)，提示TT基因型可能是新疆石河子地区汉族人群EH发生的风险基因型，携带T等位基因的新疆汉族人群易患EH的危险性较未携带人群高。

总之，本研究发现MTHFR基因C677T多态性通过影响Hcy水平而与新疆汉族人群的EH发生密切相关，T等位基因可能是新疆汉族EH人群的遗传易感基因。研究结果的不一，可能受基因和环境的共同影响。为进一步了解MTHFR C677T多态性与EH的关系，还需进行多地域、多民族、多样本的广泛研究。

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