茯砖茶不同溶剂提取物抗氧化活性研究

张小娜等

[摘要] 目的 研究茯砖茶不同溶剂提取物体外抗氧化活性，并测定其总多酚、黄酮含量。 方法 以抗坏血酸为阳性对照，采用二苯代苦味酰基（DPPH）、[2，2'-连氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐]（ABTS）及铁离子还原/抗氧化能力（FRAP）三种抗氧化模型，评价茯砖茶80%乙醇（总提物）、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水5种不同溶剂提取物体外清除DPPH、ABTS+自由基能力和对铁离子的还原/抗氧化能力。 结果 茯砖茶乙酸乙酯提取物总多酚含量最高，正丁醇提取物黄酮含量最高，分别为（291.38±5.24）、（222.86±6.12）mg/g。茯砖茶不同溶剂提取物均具有一定的抗氧化活性，清除ABTS+自由基和铁离子还原/抗氧化能力为：总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物；清除DPPH自由基的能力为：乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。茯砖茶总提物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗氧化活性，清除DPPH自由基能力的半清除率浓度（IC50）分别为0.048、0.043 g/L，清除ABTS+自由基能力的IC50分别为0.025、0.027 g/L。茯砖茶抗氧化能力与总多酚含量呈正相关。 结论 茯砖茶提取物具有良好的抗氧化能力，为开发功能性抗氧化剂提供科学依据。

[关键词] 茯砖茶；抗氧化活性；二苯代苦味酰基自由基测定法；[2，2'-连氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐]自由基测定法；铁离子还原/抗氧化能力法

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）04（a）-0009-05

Antioxidant activities of different extracts from Fuzhuan Brick Tea

ZHANG Xiaona1，2 ZOU Xianwei2，3 LI Ying1，2 ZHENG Saijing3 WANG Weimiao3 WANG Ying1，2 TANG Jintian1，2 ZHANG Yangde1，4

1.School of Chinese Materia Medical， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2.Education Ministry Key Laboratory of Technology and Radiation Imaging， Department of Engineering Physics of Tsinghua University， Beijing 100084， China； 3.Key Laboratory of Cigarette Smoke in Tobacco Industry， Shanghai Tobacco Group Corporation， Shanghai 200082， China； 4.Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center of National Health and Family Planning Commission， Central South University， Hu′nan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To study the in vitro antioxidant activities of different extracts from Fuzhuan Brick Tea and determine the total phenolics and flavonoid contents of them. Methods The antioxidant activities of its total extract （80% ethanol）， petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol， water extracts were evaluated by several in vitro experiments including DPPH assay， ABTS assay and FRAP assay with ascorbic acid as a positive control. Results The ethyl acetate extract had the highest amount of total phenolics [（291.38±5.24） mg gallic acid equivalents/g] and the n-butanol extract had the highest amount of flavonoid [（222.86±6.12） mg rutin equivalents/g）]. The different extracts from Fuzhuan Brick Tea all showed certain antioxidant capacity. The capacities of scavenging ABTS+ radicals and reducing iron were as follow： total extract > ethyl acetate > n-butanol extract >water extract> petroleum ether extract， the capacity of scavenging DPPH radicals was： ethyl acetate extract > total extract > n-butanol extract >water extract> petroleum ether extract. The total extract and ethyl acetate extract from Fuzhuan Brick Tea showed significant antioxidant activities. The total extract displayed significant capacity of scavenging DPPH and ABTS+ radicals， with IC50 values of 0.048 and 0.025 g/L， respectively. The ethyl acetate extract exhibited in vitro activity against above-mentioned two radicals， with IC50 values of 0.043 and 0.027 g/L. There was a positive correlation between the total phenolics and the antioxidant capability of them. Conclusion Different extracts from Fuzhuan Brick Tea shows strong antioxidant activities， which can be used as a potential source of natural antioxidants in food industry.

[Key words] Fuzhuan Brick Tea； Antioxidant activity； DPPH assay； ABTS assay； FRAP assay

茯砖茶属于黑茶的一种，约在公元1368年问世，是我国边疆少数民族的必需品。茯砖茶含有茶多酚、咖啡碱、氨基酸、多糖、微量元素等化学成分[1]，具有抑菌[2-4]、降脂减肥[5-6]、降血糖[7]、抗肿瘤[8]等保健功效。此外，茯砖茶还具有清除自由基[9]、保护细胞氧化受损活性[10]作用，但目前只有湖南茯砖茶水提物抗氧化活性的零星报道，不够系统全面，且茯砖茶不同极性溶剂提取物活性成分与抗氧化活性的关系尚未见报道。本研究对茯砖茶不同溶剂提取物的总多酚和黄酮含量进行了测定，并通过测定它们对DPPH和ABTS+自由基的清除能力及对Fe3+的还原能力，综合评价其抗氧化作用，为茯砖茶作为一种天然抗氧化剂的推广利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

恒温金属加热器（金银杏生物科技（北京）有限公司），酶标仪（美国BIO-RAD公司，BIO-RAD型），FW100型粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），KQ 5200 DE型超声仪（昆山市超声仪器有限公司），EYEL4旋蒸仪（日本EYELA公司），DZF-6050型真空干燥箱（北京神泰伟业仪器设备有限公司），AL204-IC型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，SHZ-CB型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂），微量移液器（美国Thermo公司），NANOpure超纯水系统（美国Barnstead公司），96孔细胞培养孔板（美国Corning公司）。

1.2 样品与试剂

茯砖茶（一品茯茶，湖南益阳茶厂）；2，2′-连氨-（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS，Amresco公司）；二苯代苦味酰基（DPPH，Alfa Aesar公司）；抗坏血酸（广州化学试剂厂）；没食子酸（中国食品药品检定研究院）；福林酚（Sigma公司）；芦丁（成都曼思特生物科技公司）；氯化铝（天津福晨化学试剂厂）常规溶剂；乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等均为北京化工厂分析产品。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的提取和制备

将3.27 kg茯砖茶粉碎，80%乙醇浸泡提取3次，分别为72，48，48 h，过滤，合并滤液，减压浓缩干燥得总提取物230 g；将总提取物加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，浓缩干燥，得石油醚提取物1.75 g，乙酸乙酯提取物64 g，正丁醇提取物82 g，水提取物38 g的不同溶剂提取物。取各不同溶剂提取物10 mg，用不同溶剂定容至10 mL（总提取物用超纯水，其余用无水乙醇），得1.0 g/L母液10 mL，分别用相应溶剂稀释，得到0.01，0.0125，0.02，0.025， 0.04，0.05 g/L的供试溶液。

2.2 总多酚、黄酮含量测定

2.2.1 总多酚含量测定

2.2.1.1 标准曲线绘制 参考文献[11]，采用Folin-Ciocalteu比色法，稍作修改。吸取质量浓度分别为0.01～0.10 g/L的没食子酸标准溶液20 μL于96孔板中，加入10%福林酚水溶液100 μL，混匀，反应5 min，加入7.5%碳酸钠溶液80 μL，混匀，室温反应1 h，在波长765 nm处测定吸光度，绘制标准曲线：Y=2.1277X- 0.0084，r2=0.999。

2.2.1.2 样品总多酚含量测定 将不同溶剂提取物样品母液稀释适当的倍数，按照上述方法显色，测定吸光度。根据标准曲线方程计算样品中总多酚含量，结果表示为没食子酸当量（mg/g）。

2.2.2 黄酮含量测定

2.2.2.1 标准曲线绘制 参考文献[12]，采用AlCl3显色法，稍作修改。吸取质量浓度分别为0.01～0.10 g/L的芦丁标准溶液50 μL于96孔板中，加入100 μL 0.1 mol/L AlCl3和50 μL醋酸-醋酸钠的缓冲液（pH 5.2），摇匀，40℃反应15 min，在400 nm处测定吸光度。绘制标准曲线：Y=1.8861X-0.0087，r2=0.999。

2.2.2.2 样品黄酮含量测定 将不同溶剂提取物样品母液稀释适当的倍数，按照上述方法测定吸光度。根据标准曲线方程计算样品中黄酮含量，结果表示为芦丁当量（mg/g）。

2.3 抗氧化活性测定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的测定

参照文献[13]的方法，略有改进。配制DPPH自由基测定液：称取7.88 mg DPPH自由基，用无水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成2×10-3 mol/L的DPPH自由基溶液，于0～4℃避光保存，备用。测定：分别移取质量浓度为0.01，0.0125，0.02，0.025，0.04， 0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL DPPH自由基测定液，迅速混匀，37℃恒温反应30 min后，在510 nm处测定吸光度。阴性对照以相应溶剂代替样品溶液，其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。VC作为阳性对照。样品的抗氧化程度用对DPPH自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越强，反之则弱。计算公式如下：

清除率=（1-A1/A0）×100%

（A0为阴性对照组吸光度；A1为样品组吸光度）。

2.3.2 清除ABTS+自由基能力的测定

参考文献[14]和文献[15]的方法，并作适当修改。配制ABTS+自由基储备液：配制2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液，二者等体积混合，避光条件下静置16 h，形成ABTS+自由基储备液。配制ABTS+自由基测定液：将ABTS+自由基储备液用溶剂稀释，使其吸光度在734 nm波长处达到0.700±0.020。测定：移取质量浓度为0.01， 0.0125，0.02，0.025，0.04， 0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL ABTS+自由基测定液，混匀，室温反应30 min，在734 nm处测定吸光度。阴性对照以相应溶剂代替样品溶液，其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。VC作为阳性对照。样品对ABTS+自由基的清除率照下面公式计算：

清除率=（1-A1/A0）×100%

（A0为阴性对照组吸光度；A1为样品组吸光度）。

2.3.3 铁离子的还原/抗氧化能力（FRAP法）

参照文献[16]的方法，略做改进。取质量浓度为0.01，0.0125，0.02，0.025，0.04，0.05 g/L的各不同溶剂提取物供试溶液1.0 mL，加入1.0 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.6），1.0 mL K3Fe（CN）6。上述混合物于50℃恒温20 min后，加入1.0 mL10%的三氯乙酸水溶液终止反应，3000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL FeCl3，混匀，在700 nm处测定吸光度A。阴性对照以相应溶剂代替样品溶液，其余步骤与样品相同。所有的测量值均做3个复孔取其平均值。VC作为阳性对照。

2.3.4 结果测定

半清除率浓度（IC50）计算根据回归方程计算清除率为50%时的浓度（g/L）。

2.4 结果

2.4.1 总多酚、黄酮含量

茯砖茶不同溶剂提取物总多酚、黄酮含量见表1。不同溶剂提取物中总多酚含量在59.90～291.38 mg/g之间，其含量从高到低依次为乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>石油醚提取物>水提取物。提取物黄酮含量在83.24～222.86 mg/g之间，其含量从高到低依次为正丁醇提取物>总提物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物。

表1 不同溶剂提取物总多酚、黄酮含量（x±s）

2.4.2 清除DPPH自由基的作用

清除DPPH自由基能力的测定结果及IC50，分别见图1和表2。从图1中可以看出，茯砖茶不同溶剂提取物对DPPH自由基均有清除作用，并且在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。各溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力顺序为：乙酸乙酯提取物>总提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物、总提物的IC50分别为0.043、0.048 g/L，略弱于阳性对照抗坏血酸（0.031 g/L），表明茯砖茶总提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。

图1 不同溶剂提取物清除DPPH自由基作用

2.4.3 清除ABTS+自由基作用

ABTS法清除自由基能力的测定结果及半清除率浓度，分别见图2和表2。茯砖茶不同溶剂提取物对ABTS+自由基都表现出一定程度的清除能力，并在实验浓度范围内呈现明显的量效关系。不同溶剂提取物对ABTS+自由基的清除能力顺序为：总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物、总提物的清除ABTS+自由基的IC50分别为0.027、0.025 g/L，略低于阳性对照抗坏血酸（0.017 g/L），表明茯砖茶总提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。

图2 不同溶剂提取物清除ABTS+自由基作用

2.4.4 铁离子的还原/抗氧化能力

从图3中可以看出，石油醚提取物铁还原能力较弱。其他溶剂提取物随着浓度增加，吸光度逐渐增大，表明在实验浓度范围内，样品浓度越高，还原能力越强。不同溶剂提取物铁离子还原能力的顺序为：总提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物>石油醚提取物。

图3 不同溶剂提取物铁离子还原能力

2.4.5 总多酚、黄酮含量与抗氧化活性的相关性

茯砖茶不同溶剂提取物清除DPPH、ABTS+自由基的能力与总多酚含量的相关系数分别为0.9294、0.8845，相关性良好。而黄酮含量与DPPH、ABTS+自由基清除能力以及还原力的相关系数分别为0.1818、0.3031和0.2694，相关性较差。分析表明总多酚含量与抗氧化活性呈正相关，推测酚类物质是茯砖茶提取物清除自由基及抗氧化的主要成分。

3 讨论

自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的分子或原子，其化学性质相当活跃[17]，对DNA、蛋白质和脂质等生物大分子发生破坏性反应，损害机体的组织和细胞，进而引起各种病变[18-19]。现已明确许多疾病或症状，如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等都与自由基有关[20]。植物中多酚[21]、黄酮[22]等活性物质能够清除过剩的自由基，具有一定的抗氧化活性。

本文采用FRAP法、DPPH法和ABTS法对茯砖茶不同溶剂提取物进行了抗氧化活性研究，比较了茯砖茶不同溶剂提取物对铁的还原抗氧化能力和对DPPH及ABTS+两种自由基的清除能力，并测定了茯砖茶不同溶剂提取物中总多酚和黄酮的含量。结果表明，茯砖茶不同溶剂提取物均具有清除自由基、抑制铁氧化的能力，其中总提物清除ABTS+自由基（IC50为0.025 g/L）及还原Fe3+的能力最强，乙酸乙酯提取物清除ABTS+自由基（IC50为0.027 g/L）及还原Fe3+的能力次之，石油醚提取物清除ABTS+自由基（IC50为0.556 g/L）及还原Fe3+的能力最弱。清除DPPH自由基方面，乙酸乙酯提取物清除能力最强（IC50为0.043 g/L），总提物清除能力次之（IC50为0.048 g/L），石油醚提取物清除能力最弱（IC50为0.456 g/L）。而茯砖茶不同极性提取物总多酚、黄酮含量测定表明：茯砖茶不同极性部位均能提取出一定量的总多酚和黄酮，其中以乙酸乙酯和正丁醇提取物含量较多。分析茯砖茶不同溶剂提取物抗氧化能力与总多酚黄酮含量的关系，结果表明随着总多酚含量提高，抗氧化活性提高，说明了抗氧化活性与其所含的多酚有一定关系。

通过茯砖茶不同溶剂提取物的体外抗氧化实验评价，表明茯砖茶具有良好的抗氧化活性，为进一步利用茯砖茶活性成分作为天然抗氧化剂用于食品工业及卷烟过滤烟嘴等提供科学依据。

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（收稿日期：2013-10-03 本文编辑：卫 轲）

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（收稿日期：2013-10-03 本文编辑：卫 轲）