连接蛋白43在胎盘组织中的表达及与妊娠糖尿病的相关研究

连接蛋白43在胎盘组织中的表达及与妊娠糖尿病的相关研究+付长霞+刘立昌+张春香+吕世军

[摘要] 目的 观察连接蛋白43（connexin43，Cx43）在妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）患者胎盘组织中的表达，探讨Cx43及其构成的缝隙连接细胞间通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）在GDM胎盘组织中的作用。 方法 应用免疫组织化学法和Western blotting法检测GDM未治疗组（18例）、GDM治疗组（22例）和正常妊娠组（12例）胎盘组织中Cx43的定位和表达。 结果 免疫组织化学染色显示Cx43表达在滋养细胞的细胞浆及细胞膜。GDM未治疗组Cx43阳性颗粒主要集中在细胞浆中，且明显减少。GDM未治疗组Cx43蛋白水平明显低于其他两组（P<0.05）。结论 Cx43在GDM未治疗组的滋养细胞低表达，提示滋养细胞间GJIC异常，导致GDM胎盘滋养细胞间融合、分化异常， 可能与GDM的不良妊娠有关。

[关键词] 妊娠糖尿病；胎盘；连接蛋白43

[中图分类号] R714.25 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）14-0045-03

妊娠糖尿病（gestational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠首次发生和发现的不同程度的糖代谢异常，包括妊娠前已经存在但被漏诊的孕前糖尿病者以及孕期伴随发生的糖耐量异常者[1]。缝隙连接（gap junction，GJ）和细胞缝隙连接通讯（gap junction intercellular communication，GJIC）可以调控细胞增殖、细胞凋亡，参与细胞的生长抑制和转化[2]。Cx43是连接蛋白基因家族中分布最广、研究最多的一个连接蛋白。目前国内外文献中鲜有关于Cx在GDM胎盘中表达情况的研究报道。本研究通过检测Cx43在GDM孕妇胎盘中的表达，探讨Cx43及其构成的GJIC对GDM胎盘发育的影响，为GDM的发病机制提供新的理论根据。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2011年7月～2012年6月于潍坊市中医院产科住院分娩的妇女，均排除孕前有糖尿病病史。参考2010年美国糖尿病学会（American Diabetes Association，ADA）的诊断标准[3]将患者分为三组，GDM未治疗组18例，GDM治疗组22例，正常妊娠妇女12例，三组孕妇年龄、分娩孕周比较，差异无统计学意义（P>0.05）。三组孕妇均无烟酒嗜好，既往无高血压、血液病、肾脏疾病、代谢性疾病等病史。

1.2 方法

1.2.1标本采集 三组孕妇均于胎盘娩出后胎盘称重，直视下选取胎盘母面中央带与中间带组织（避开钙化， 机化灶），将其分为两部分：一部分切成约2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小块组织，用4%福尔马林固定，做石蜡切片；另一部分切成约0.5 cm3的小块，置于DEPC处理过的冻存管中，标记后放入-70℃冰箱低温保存备用。

1.2.2 免疫组织化学染色 试剂来源：兔抗人Cx43多克隆抗体（1∶1000美国，Zyned），SP免疫组化染色试剂盒（北京中山生物技术公司），DAB显示试剂盒（武汉博士德公司），APES粘片剂（北京中山生物技术公司）。免疫组化方法按试剂盒说明书进行。

1.2.3 Western blotting法检测胎盘组织中Cx43蛋白的表达 提取胎盘绒毛组织蛋白，用考马斯亮兰法测定蛋白质浓度。制作12%的分离胶和5%的积层胶，每泳道上样量20 μL，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h，加兔抗人Cx43多克隆抗体（1∶300 美国，Zyned） 4℃冰箱孵育过夜，TBST溶液摇床漂洗膜3次，每次15min。HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶1000 美国Zymed 公司） 室温孵育2 h，同法洗膜3次，ECL发光试剂盒显影、X线片感光后显影定影，清水冲净晾干。应用BiospectrumAC 凝胶成像分析系统扫描分析。

1.3 结果判断

1.3.1 Cx43的阳性判断及分级标准 每张切片随机观察10个不重复的高倍（400×）视野，每个视野中根据滋养细胞的阳性细胞占观察同类细胞总数的百分率分为：阴性（-）：阳性细胞<5%（0分），阳性（+）：细胞比较集中，阳性细胞5%～25%（1分）；（++）：阳性细胞为25%～75%（2分）；（+++）：阳性细胞>75%（3分）。细胞染色强度评分：阴性（0分）；浅黄色为弱阳性+（1分）；棕黄色为阳性++（2分）；细胞呈棕褐色为强阳性（+++）（3分）。Cx43评分=细胞染色率评分+细胞染色强度评分。0分为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。

1.3.2 Western blotting结果判定 应用BiospectrumAC 凝胶成像分析系统扫描、用凝胶定量软件Quantity One测定各组目的蛋白和β-actin的积分灰度值。数据处理时用各组积分灰度值除以内参照β-actin条带的积分灰度值获得相对积分灰度值的比值，用均数±标准差表示。

1.4 统计学分析

运用 SAS8.0统计学软件进行数据处理和分析，其中计数资料采用Kruskal-Wallis秩和检验，计量资料采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1免疫组织化学染色

2.1.1观察Cx43在胎盘滋养细胞表达的定位 利用免疫组织化学方法检测Cx43在GDM未治疗组、GDM治疗组及正常对照组胎盘滋养细胞中表达，在绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞和血管内皮细胞的细胞膜上可见棕色颗粒，呈线性排列，在细胞浆上可见少数棕色颗粒。实验结果显示：Cx43表达于绒毛滋养层细胞、绒毛间质纤维细胞和血管内皮细胞，且在滋养细胞的细胞膜上表达最为明显（图1、2、3）。

2.1.2三组胎盘Cx43的免疫组化及分析 本研究中三组Cx43蛋白表达结果显示为Cx43+，Cx43++，Cx43+++，无阴性表达（表1）。对三组的胎盘滋养细胞的表达强度进行分析，经Kruskal-Wallis秩和检验，差异有显著性（Hc=15.04，P=0.0005），说明三组的Cx43蛋白在胎盘滋养细胞的表达强度不同。其中GDM未治疗组与GDM治疗组表达强度差异有显著性（秩次之差为14.306，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于GDM治疗组；GDM未治疗组与正常对照组表达强度差异有显著性（秩次之差为18.431，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于正常对照组；GDM治疗组与正常对照组表达强度差异无统计学意义（秩次之差为4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表达

取三组胎盘组织的总蛋白各10 μL做免疫印迹，检测Cx43（43KD）表达水平。以分子量为36KD羊抗人抗β-actin单克隆抗体为内参照。Cx43蛋白水平在三组标本中均存在表达（图4）。各组胎盘组织的相对积分灰度值比值用均数±标准差表示。各组总体均数比较结果，见表2。

3 讨论

GDM是妊娠期最常见的并发症之一，其发病率呈逐年上升趋势，且各国报道不一，约1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM妇女发展成为2型糖尿病的风险极高，其后代在19～27岁之间发展成为糖尿病或糖耐量异常的几率增高8倍。GDM对后代的负面影响包括：肥胖、胰岛素缺陷等[6]。GDM导致的近期及远期母婴并发症的危害极大，故GDM一直为医学界所关注。

Cx43是Cx基因家族中数量最为丰富的成员，迄今已发现存在于34种组织和46种细胞中[7]。各类Cx分子序列和长度上的差别主要在羧基末端和胞内环部分，它们决定了所组成的GJ具有不同的理化和调节特性。

本研究免疫组织化学结果显示Cx43在正常对照组主要定位于细胞滋养细胞和合体滋养细胞的细胞膜上，细胞浆也有表达，但在GDM未治疗组却发现Cx43表达主要在细胞浆表达，而且表达减少。据此推测是由于Cx43定位异常所致。Cx定位异常即Cx由细胞膜转移至细细胞浆、细胞核或细胞膜的其他部位，这样将导致Cx在错误定位处无法与邻近细胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治疗组较GDM未治疗组和正常对照组的胎盘组织中的表达明显减少，原因可能是Cx43基因在转录前或是转录过程中发生了改变，也可能与转录后的翻译或是翻译后蛋白质的加工修饰过程异常相关[8]。GDM胎盘中Cx43蛋白的表达下调，可能直接影响GJ的形成，导致GJIC异常，机体对CTs的监视和调控能力减弱，滋养细胞会过度克隆生长，这可能是GDM形成过程中造成胎盘改变的重要分子机制之一。GJIC是维持细胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的众多调控环节中任何一处异常均会导致细胞生长失控。滋养细胞中GJIC异常机制及这种异常如何影响滋养细胞的增殖、融合和分化等发生发展的研究才刚刚起步，深入研究GJIC在GDM发生时的异常机制，阐明GJIC对滋养细胞生长调控的原理，将会使人们更深入地认识GDM发生发展的原因，为GDM的防治提供更多的新靶点。

本研究通过观察Cx43表达与GDM胎盘发病机制的关系，为进一步阐明GDM的发病机制提供理论依据。发现在早期治疗的GDM孕妇胎盘中Cx43的表达与正常妊娠组的表达无差异，说明提高早期诊治对GDM发展具有重要意义，也有文献[9]指出孕前或孕中参与体育活动可能会降低患GDM的风险，建议每天进行30 min以上中等强度的体育锻炼。

[参考文献]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care

2.1.2三组胎盘Cx43的免疫组化及分析 本研究中三组Cx43蛋白表达结果显示为Cx43+，Cx43++，Cx43+++，无阴性表达（表1）。对三组的胎盘滋养细胞的表达强度进行分析，经Kruskal-Wallis秩和检验，差异有显著性（Hc=15.04，P=0.0005），说明三组的Cx43蛋白在胎盘滋养细胞的表达强度不同。其中GDM未治疗组与GDM治疗组表达强度差异有显著性（秩次之差为14.306，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于GDM治疗组；GDM未治疗组与正常对照组表达强度差异有显著性（秩次之差为18.431，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于正常对照组；GDM治疗组与正常对照组表达强度差异无统计学意义（秩次之差为4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表达

取三组胎盘组织的总蛋白各10 μL做免疫印迹，检测Cx43（43KD）表达水平。以分子量为36KD羊抗人抗β-actin单克隆抗体为内参照。Cx43蛋白水平在三组标本中均存在表达（图4）。各组胎盘组织的相对积分灰度值比值用均数±标准差表示。各组总体均数比较结果，见表2。

3 讨论

GDM是妊娠期最常见的并发症之一，其发病率呈逐年上升趋势，且各国报道不一，约1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM妇女发展成为2型糖尿病的风险极高，其后代在19～27岁之间发展成为糖尿病或糖耐量异常的几率增高8倍。GDM对后代的负面影响包括：肥胖、胰岛素缺陷等[6]。GDM导致的近期及远期母婴并发症的危害极大，故GDM一直为医学界所关注。

Cx43是Cx基因家族中数量最为丰富的成员，迄今已发现存在于34种组织和46种细胞中[7]。各类Cx分子序列和长度上的差别主要在羧基末端和胞内环部分，它们决定了所组成的GJ具有不同的理化和调节特性。

本研究免疫组织化学结果显示Cx43在正常对照组主要定位于细胞滋养细胞和合体滋养细胞的细胞膜上，细胞浆也有表达，但在GDM未治疗组却发现Cx43表达主要在细胞浆表达，而且表达减少。据此推测是由于Cx43定位异常所致。Cx定位异常即Cx由细胞膜转移至细细胞浆、细胞核或细胞膜的其他部位，这样将导致Cx在错误定位处无法与邻近细胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治疗组较GDM未治疗组和正常对照组的胎盘组织中的表达明显减少，原因可能是Cx43基因在转录前或是转录过程中发生了改变，也可能与转录后的翻译或是翻译后蛋白质的加工修饰过程异常相关[8]。GDM胎盘中Cx43蛋白的表达下调，可能直接影响GJ的形成，导致GJIC异常，机体对CTs的监视和调控能力减弱，滋养细胞会过度克隆生长，这可能是GDM形成过程中造成胎盘改变的重要分子机制之一。GJIC是维持细胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的众多调控环节中任何一处异常均会导致细胞生长失控。滋养细胞中GJIC异常机制及这种异常如何影响滋养细胞的增殖、融合和分化等发生发展的研究才刚刚起步，深入研究GJIC在GDM发生时的异常机制，阐明GJIC对滋养细胞生长调控的原理，将会使人们更深入地认识GDM发生发展的原因，为GDM的防治提供更多的新靶点。

本研究通过观察Cx43表达与GDM胎盘发病机制的关系，为进一步阐明GDM的发病机制提供理论依据。发现在早期治疗的GDM孕妇胎盘中Cx43的表达与正常妊娠组的表达无差异，说明提高早期诊治对GDM发展具有重要意义，也有文献[9]指出孕前或孕中参与体育活动可能会降低患GDM的风险，建议每天进行30 min以上中等强度的体育锻炼。

[参考文献]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care

2.1.2三组胎盘Cx43的免疫组化及分析 本研究中三组Cx43蛋白表达结果显示为Cx43+，Cx43++，Cx43+++，无阴性表达（表1）。对三组的胎盘滋养细胞的表达强度进行分析，经Kruskal-Wallis秩和检验，差异有显著性（Hc=15.04，P=0.0005），说明三组的Cx43蛋白在胎盘滋养细胞的表达强度不同。其中GDM未治疗组与GDM治疗组表达强度差异有显著性（秩次之差为14.306，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于GDM治疗组；GDM未治疗组与正常对照组表达强度差异有显著性（秩次之差为18.431，P<0.05），GDM未治疗组表达强度低于正常对照组；GDM治疗组与正常对照组表达强度差异无统计学意义（秩次之差为4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表达

取三组胎盘组织的总蛋白各10 μL做免疫印迹，检测Cx43（43KD）表达水平。以分子量为36KD羊抗人抗β-actin单克隆抗体为内参照。Cx43蛋白水平在三组标本中均存在表达（图4）。各组胎盘组织的相对积分灰度值比值用均数±标准差表示。各组总体均数比较结果，见表2。

3 讨论

GDM是妊娠期最常见的并发症之一，其发病率呈逐年上升趋势，且各国报道不一，约1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM妇女发展成为2型糖尿病的风险极高，其后代在19～27岁之间发展成为糖尿病或糖耐量异常的几率增高8倍。GDM对后代的负面影响包括：肥胖、胰岛素缺陷等[6]。GDM导致的近期及远期母婴并发症的危害极大，故GDM一直为医学界所关注。

Cx43是Cx基因家族中数量最为丰富的成员，迄今已发现存在于34种组织和46种细胞中[7]。各类Cx分子序列和长度上的差别主要在羧基末端和胞内环部分，它们决定了所组成的GJ具有不同的理化和调节特性。

本研究免疫组织化学结果显示Cx43在正常对照组主要定位于细胞滋养细胞和合体滋养细胞的细胞膜上，细胞浆也有表达，但在GDM未治疗组却发现Cx43表达主要在细胞浆表达，而且表达减少。据此推测是由于Cx43定位异常所致。Cx定位异常即Cx由细胞膜转移至细细胞浆、细胞核或细胞膜的其他部位，这样将导致Cx在错误定位处无法与邻近细胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治疗组较GDM未治疗组和正常对照组的胎盘组织中的表达明显减少，原因可能是Cx43基因在转录前或是转录过程中发生了改变，也可能与转录后的翻译或是翻译后蛋白质的加工修饰过程异常相关[8]。GDM胎盘中Cx43蛋白的表达下调，可能直接影响GJ的形成，导致GJIC异常，机体对CTs的监视和调控能力减弱，滋养细胞会过度克隆生长，这可能是GDM形成过程中造成胎盘改变的重要分子机制之一。GJIC是维持细胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的众多调控环节中任何一处异常均会导致细胞生长失控。滋养细胞中GJIC异常机制及这种异常如何影响滋养细胞的增殖、融合和分化等发生发展的研究才刚刚起步，深入研究GJIC在GDM发生时的异常机制，阐明GJIC对滋养细胞生长调控的原理，将会使人们更深入地认识GDM发生发展的原因，为GDM的防治提供更多的新靶点。

本研究通过观察Cx43表达与GDM胎盘发病机制的关系，为进一步阐明GDM的发病机制提供理论依据。发现在早期治疗的GDM孕妇胎盘中Cx43的表达与正常妊娠组的表达无差异，说明提高早期诊治对GDM发展具有重要意义，也有文献[9]指出孕前或孕中参与体育活动可能会降低患GDM的风险，建议每天进行30 min以上中等强度的体育锻炼。

[参考文献]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care