免疫组化与荧光原位杂交检测乳腺癌组织中HFR-2蛋白表达与基因扩增的比较分析

李海梅，李军扩，杜娴娟，赵 芳

（1.安阳市肿瘤医院病理科，河南安阳455000；2.安阳市肿瘤医院分子生物学实验室，河南安阳455000）

免疫组化与荧光原位杂交检测乳腺癌组织中HFR-2蛋白表达与基因扩增的比较分析

李海梅1，李军扩1，杜娴娟2，赵 芳2

（1.安阳市肿瘤医院病理科，河南安阳455000；2.安阳市肿瘤医院分子生物学实验室，河南安阳455000）

目的比较观察免疫组化（IHC）法检测乳腺癌组织中HFR-2蛋白表达和荧光原位杂交（FISH）法检测其HFR-2基因扩增在乳腺癌分子靶向治疗中的临床意义。方法采用IHC法及FISH法分别检测111例乳腺癌组织中HFR-2蛋白表达及HFR-2基因扩增情况。结果111例乳腺癌标本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因扩增74例，未扩增37例。2种检测结果呈正相关关系（rs=0.625，P＜0.05）。结论IHC法检测HFR-2蛋白可作为乳腺癌患者是否应用赫赛汀的初筛，HFR-2蛋白表达阳性的患者有必要进一步进行HFR-2基因扩增检测，来确定临床治疗是否应用赫赛汀。

乳腺癌；HFR-2；免疫组织化学；荧光原位杂交

近年来，一些临床研究［1］表明，20% ～30%的乳腺癌患者存在HFR-2基因扩增或蛋白过表达的情况，与患者的转移、不良预后及复发密切相关。针对HFR-2基因的靶向药物郝赛汀能有效延长乳腺癌患者的生存期，但是该药物仅对HFR-2基因过表达的患者有效，因此，检测该基因对乳腺癌患者的治疗和预后有重要的意义，也是指导郝赛汀应用的惟一指标。目前，检测HFR-2状态的方法有荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）等。本研究通过IHC法和FISH法检测安阳市肿瘤医院111例乳腺癌患者中HFR-2情况，比较2种方法的应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取安阳市肿瘤医院2011年6月到2012年2月乳腺癌手术切除标本，所有患者术前均未进行任何治疗，经病理证实均为浸润性导管癌。

1.2 IHC检测及结果判定采用IHC法按照试剂盒说明检测HFR-2蛋白表达，一抗及试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，结果判定参照乳腺癌HFR-2检测指南（2009版）执行：无着色为0，任何比例的浸润癌细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色为（+）；＞10%的浸润癌细胞呈现弱至中等强度，完整但不均匀的细胞膜棕黄着色或＜30%的浸润癌细胞呈现强且完整的细胞膜棕黄着色为（++）；＞30%的浸润癌细胞呈现强的、完整的细胞膜棕黄着色为（+++）。由于（+）和（-）均记为阴性，在统计分析时进行合并。

1.3 FISH检测及结果判定采用FISH法按照试剂盒说明进行 HFR-2基因扩增的检测，该方法可将HFR-2基因标记为红色，17号染色体基因标记为绿色。乳腺癌HFR-2探针试剂盒购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。主要步骤包括从石蜡包埋组织中获取4 μm切片，然后进行样本载玻片的预处理、变性处理、探针与样本杂交、玻片洗脱和荧光显微镜观察，观察30个肿瘤细胞，计算Ratio值（Ratio值为30个细胞核中红色信号总数/30个细胞核中绿色信号总数）。Ratio值＜1.8为阴性，提示该样本无HFR-2基因扩增；Ratio值＞2.2为阳性，提示样本中HFR-2基因扩增，红信号点成簇扩增也记为HFR-2基因扩增；Ratio值为1.8～2.2时，增加计数细胞至100个或换一位计数者重新计算，或重做FISH检测来判断最终结果。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0进行分析，计数资料比较采用χ2检验，IHC法与FISH法检测HFR-2状态之间的相关性检验采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

111例乳腺癌标本中，HFR-2蛋白（+++）者53例，（++）者47例，（+）或（-）者11例；基因扩增74例，未扩增37例。2种检测结果呈正相关关系（rs= 0.625，P＜0.05）。见表1。

表1 乳腺癌组织中HFR-2蛋白表达和HFR-2基因扩增结果的关系 n

3 讨论

原癌基因HFR-2定位于人的17号染色体上，编码相对分子质量185 000的跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，是生长因子受体家庭成员，HFR-2主要是通过配体与受体结合形成同源或异源二聚体，进一步引起胞内区的酪氨酸残基的自身磷酸化，这种磷酸化激活了下游的信号转导途径，从而在肿瘤的发生、发展中起到重要的作用［2］。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌等的细胞中可检测到HFR-2基因扩增或蛋白的过表达，约20%～30%的乳腺癌组织中HFR-2蛋白会发生过表达，其中90%以上是由于基因扩增造成的。HFR-2基因的扩增和蛋白的过表达提示对某些常规的化疗和激素治疗反应性差，预后通常较差。针对HFR-2受体的曲妥珠单抗是一种单克隆抗体，是当代乳腺癌靶向治疗的代表性药物。其治疗乳腺癌的作用机制主要是通过抗体依赖的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用杀伤 HFR-2高表达的肿瘤细胞；介导HFR-2受体的内吞降解而减少其在细胞表面的密度，抑制肿瘤的进一步生长［3-4］。因此，对HFR-2基因状态的评估已经成为乳腺癌患者采用适当治疗方法的基本程序［5］。

IHC法是目前临床常用的检测HFR-2受体蛋白表达的方法。该方法简单易行，可重复性好。但由于其检测对象为HFR-2受体蛋白，在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，还有17号染色体的非整倍体现象会使检测出现假阳性结果，加上结果主观判断的误差等，可直接影响结果的可靠性。FISH法是分子遗传学常用的检测技术，不仅可以用于异常染色体的检测，也可以用于观察目标基因的扩增情况，具有高稳定性、高准确性和高灵敏性的特点。特别是在乳腺癌患者 HFR-2的检测方面，目前认为FISH法是检测HFR-2这条FGFR通路是否过度活化的金标准。研究［6］显示，这2种方法的检测结果之间相关性较好。

本项研究结果显示，在53例HFR-2蛋白（+++）的病例中有50例基因有扩增，3例基因为未扩增；在47例HFR-2蛋白（++）的病例中有24例基因有扩增，23例基因未扩增（其中有4例为多体未扩增）；11例HFR-2蛋白（+）或（-）的病例均未见基因未扩增。结果表明在蛋白表达为（+++）和（+）或（-）的组别中2种检测方法的符合率较高，而在蛋白表达为（++）的组别中符合率较低，值得注意的是在23例基因未扩增的HFR-2蛋白（++）病例中，有4例为多体未扩增，赵坡等［7］的研究显示17号染色体多体的乳腺癌赫赛汀用药组患者较未用药组复发率低。至于17号染色体与乳腺癌患者的用药选择、预后等关系，国内外可参考的文献尚少，需要进一步更深入的研究。综合本文初步结果，我们认为临床应用IHC法检测乳腺癌HFR-2蛋白表达具有一定的准确度，其检测结果对乳腺癌患者的诊断治疗及预后情况有一定的指导作用。但是本研究显示，IHC法与具有高度稳定性和可靠性的FISH法结果相比较，存在部分假阳性的检测结果。综上所述，IHC法检测HFR-2蛋白可作为乳腺癌患者是否应用赫赛汀的初筛，HFR-2蛋白表达阳性的患者有必要进一步进行HFR-2基因扩增检测，来确定临床治疗是否应用赫赛汀。

［1］ Surowiak P，Materna V，Kaplenko I，et al.Topoisomerase 1A，HFR/ 2neu and Ki67 expression in paired primary andr elapse ovarian cancer tissue samples［J］.Histol Histopathol，2006，21（7）：713 -720.

［2］ Fernö M，Haglund M，Bendahl PO，et al.Quality assured HFR2 analysis in breast cancer.Important therapeutic predictive and prognostic factor［J］.Lakartidningen，2008，105（32/33）：2181-2184.

［3］ 万美珍，凌扬，徐志毅，等.荧光原位杂交与免疫组化检测乳腺癌组织HFR-2基因扩增或蛋白表达情况的比较分析［J］.肿瘤基础与临床，2010，23（1）：16-18.

［4］ Vogel CL，Cobleigh MA，Tripathy D，et al.Ffficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HFR2-overexpressing metastatic breast cancer［J］.J Clin Oncol，2002，20（3）：719-726.

［5］ Shak S.Overview of the trastuzumab（Herceptin）anti-HFR2 monoclonal antibody clinical program in HFR2-overexpressing metastatic breast cancer.Herceptin Multinational Investigator Study Group［J］.Semin Oncol，1999，26（4 Suppl 12）：71-77.

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［7］ 赵坡，姜学革，李晓瑛，等.FISH检测乳腺癌HFR-2基因扩增及17号染色体多体状况及其临床病理学意义的分析［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18（9）：680-683.

Comparative Analysis of Immunohistochemistry and Fluorescence in Situ Hybridization in Detecting HER-2 in Breast Cancer

Li Haimei1，Li Junkuo1，Du Xianjuan2，Zhao Fang2
（1.Department of Pathology，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China；2.Molecular Biology Laboratory，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China）

ObjectiveTo explore the clinical significance of HFR-2 protein expression detected by immunohistochemistry（IHC）and HFR-2 gene amplification detected by fluorescence in situ hybridization（FISH）in molecular targeting therapy of breast cancer.MethodsThe HFR-2 protein expressions and the HFR-2 gene amplification in the 111 cases of breast cancer tissues were detected by IHCa nd FISH，respectively.ResultsThe numbers of patients showed IHC（+++），IHC（+++）and IHC（+/-）were 53 cases，47 cases and 11 cases，respectively.The HFR-2 gene amplification existed in the 74 cases，no amplification existed in the 37 cases.There was positive correlation between the two results（rs=0.625，P＜0.05）.ConclusionBefore herceptin therapy，the immunohistoche-mistry can be first used to detect the HFR-2 protein expressions，and then in the cases woth positive expressions of HFR-2，the HFR-2 gene amplifications should be further tested to guide the herceptin therapy in the treatment of breast cancer.

breast cancer；HFR-2；immunohistochemistry；fluorescence in situ hybridization

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.03.004

R737.9

A

1673-5412（2014）03-0196-03

2013-04-19）

李海梅（1980-），女，主治医师，主要从事肿瘤病理诊断及研究。F-mail：296156543@qq.com