寻常型银屑病血热证患者外周血Th17细胞活化和增殖相关因子的表达

田海刚，吴厚男，王建峰，郭付云，黄彬彬，杨旭芳，苗朝阳，张晓艳*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京大学医学部细胞分析实验室，北京 100083；

3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大学医学部，北京 100083；5.中日友好医院皮肤科，北京 100029）

寻常型银屑病血热证患者外周血Th17细胞活化和增殖相关因子的表达

田海刚1，吴厚男2，王建峰1，郭付云1，黄彬彬1，杨旭芳3，苗朝阳4，张晓艳5*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京大学医学部细胞分析实验室，北京 100083；

3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；4.北京大学医学部，北京 100083；5.中日友好医院皮肤科，北京 100029）

目的 探讨Th17细胞活化和增殖相关因子在寻常型银屑病血热证发病机制中的作用以及寻常型银屑病血热证的物质基础与辨证依据。方法 收集我院皮肤科门诊寻常型银屑病血热证患者12例为观察组，11例正常人为对照组。通过多色流式细胞术检测两组外周血Thl7细胞活化相关因子HLA-DR、增殖因子Ki-67表达水平。结果 观察组外周血Thl7细胞活化因子HLA-DR的表达及增殖因子Ki-67的表达均高于对照组（P<0.05）；但活化因子HLA-DR及增殖因子Ki-67与银屑病的病情及严重程度指数（PASI）评分均无相关性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。结论 Th17细胞活化因子HLA-DR和增殖因子Ki-67在银屑病血热证患者外周血中表达上调，提示银屑病血热证患者外周血Th17细胞处于高活化状态且增殖活跃，二者可能间接参与了银屑病血热证的发病过程，是银屑病血热证新的物质基础与辨证依据。

寻常型银屑病；血热证；Th17细胞；活化；增殖

近年来，银屑病被认为是一种T细胞介导的自身免疫性炎症性皮肤病，尤其是Th17细胞在本病的发病中发挥了重要作用，尽管国内外对其发病机制做了大量研究，但迄今其病因及发病机制仍不明确。中医学多认为急性期银屑病的主要病因是 “血分有热”，从而确立血热证的论治策略。本研究应用多色流式细胞仪，对银屑病血热证患者外周血CD4+的Th17淋巴细胞活化相关标志HLA-DR和增殖核蛋白Ki-67进行检测，研究银屑病血热证患者外周血是否存在Th17细胞活化和增殖，并与健康人进行比较，为进一步阐明银屑病免疫发病机制和银屑病血热证物质基础提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 西医诊断标准 参照 《临床皮肤病学》[1]，皮损为红色的丘疹、斑疹，可融合成片，边缘明显，上覆多层银白色鳞屑，将鳞屑刮去后有发亮薄膜，再刮除薄屑有点状出血现象 (称为薄膜现象和点状出血现象，即Auspitz征)。所有病例均有典型皮损并经组织病理证实。

1.1.2 中医诊断标准 银屑病血热证的诊断标准参照《中华人民共和国中医药行业标准·中医皮肤科病症诊断疗效标准》[2]，其主症包括新皮损不断出现，以丘疹、斑丘疹为主，皮损基底皮肤颜色鲜红，刮去鳞屑有点状出血，有同形反应；次症包括初发或复发，可有不同程度的瘙痒、心烦、口渴或口干、便秘、尿黄、舌质红、苔黄、脉数，具备以上主症及次症2项以上者即可诊断。

1.1.3 纳入标准 （1）符合西医寻常型银屑病诊断标准；（2）符合银屑病血热证的辨证标准；（3）年龄在18～65岁，无家族史，男女不限；（4）3个月内无系统应用免疫抑制剂、糖皮质激素或维甲酸类药物治疗史，近2周内无外用药物史；（5）身心健康，无其他内科疾病，血尿便常规、肝肾功能及其他生化指标正常；（6）签署知情同意书。

1.1.4 排除标准 （1）关节型、脓疱型、红皮病型银屑病；（2）妊娠、孕妇、哺乳期患者；（3）有严重心、肝、肾疾患，糖尿病、高血压、高血脂、恶性肿瘤等系统疾病患者；（4）既往有病毒性肝炎等传染病病史。

1.2 一般资料

收集2013年12月至2014年3月我院皮肤科门诊诊断为寻常型银屑病血热证患者12例 （观察组），其中男6例，女6例；年龄18～47岁，平均(30.58±9.74)岁；病程2～38.5年，平均 13.07年；皮损面积5.5%～82%，平均31.2%；银屑病的病情及严重程度指数（PASI）评分6～38.9，平均14.53。正常人11例为对照组，其中男6例，女5例；年龄23～34岁，平均（28.36±3.78）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3 检测方法

1.3.1 主要试剂与仪器 APC-H7-CD3，BV421-CD4，PE-Cy7-CD56，FITC-HLA-DR，PE-TCR-γδ均购自BD公司；BV570-CD8(购自BioLegend公司)；PerCP-Cyanine5.5-IL-17A，FITC-Ki-67，APCRORgammat，FITC-MOUSE-IgG2a均购自 eBioscience公司；PMA(佛波脂)，Ionomycin(离子霉素)，Brefeldin-A(BFA，布雷菲德霉素A)均为Sigma公司产品；SEries 8000DH CO2Incubator（Thermo scientific公司），GALLIOS流式细胞仪（BECKMAN COULTER公司）。

1.3.2 外周血标本采集与处理 于无菌状态下采集寻常型银屑病血热证患者与健康志愿者清晨空腹静脉血2 mL，用肝素钠抗凝管，标本的处理在4 h之内完成。

1.3.3 外周血细胞的体外培养刺激 刺激：在流式管中加入500 μL全血+500 μL预先配好的1640培养液、PMA工作液 （100 ng/mL）、Ionomycin工作液（1 μg/mL）、BFA工作液 （10 μg/mL）。孵育：将加好培养液的标本放置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育5 h，期间每隔1 h轻轻摇晃混匀1次。培养结束后，收集细胞。

1.3.4 细胞染色 表面标记的染色：在相应的单阳对照管加入对应的单个抗体 5 μL，Mouse-IgG、TCR-γδ和HLA-DR加量为10 μL，室温避光孵育30 min。同型对照管中加入上述量的抗体MOUSEIgG2a、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室温避光孵育30 min。样本管1中加入上述量抗体HLA-DR、CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8， 室温避光孵育30 min。样本管2中加入上述量抗体CD56、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8，室温避光孵育30 min。破膜：在单阳对照管HLA-DR、TCR-γδ、CD3、CD4、CD8、CD56中各加入1X破膜液1 mL，混匀，室温避光放置30 min。所有管加入2 mL buffer，振动混匀1 300 r／min，4℃，离心 5 min，去上清后再加入2 mL buffer，1 300 r／min，4℃，离心5 min，去上清。核内染色：在1、2单阳对照管中加入IL-17A和RORC2对应抗体各5 μL，室温避光孵育30 min。样本管1中加入抗体IL-17A和RORC2；样本2管中加入IL-17A和RORC2，Ki-67；30 min避光孵育后，各管加2 mL的buffer洗涤，1 300 r／min，4℃，离心5 min。去上清，加200 μL PBS悬浮细胞，混匀后上机检测。用Gallios软件进行数据分析。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组Th17细胞免疫活化分子HLA-DR表达及增殖相关分子Ki-67表达的比较

观察组Th17细胞表面活化标记物HLA-DR的表达率及增殖标记物Ki-67表达率均高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 Th17细胞免疫活化分子HLA-DR表达及增殖相关分子Ki-67表达的比较 （±s，%）

表1 Th17细胞免疫活化分子HLA-DR表达及增殖相关分子Ki-67表达的比较 （±s，%）

注：与对照组比较△P<0.05。

组别对照组观察组例数11 12 HLA-DR Ki-67 8.016±2.334 5.665±2.251 11.686±4.799△ 8.727±3.854△

2.2 观察组外周血Th17细胞活化状态及增殖程度与PASI评分的相关性

通过Spearman和Kendall相关系数检验，提示Th17细胞活化状态及增殖程度与PASI评分均无相关性（r1=-0.021，r2=0.098，均P>0.05）。

3 讨论

银屑病的病因和发病机制尚未完全明确。目前认为是T细胞与角质形成细胞相互作用所致，由活化T细胞产生的淋巴因子刺激表皮增殖，而增殖角质形成细胞又释放其他细胞因子增强活化T细胞作用，形成T细胞介导的恶性循环。可见，活化的T细胞是银屑病发病机制中的主要调节因子[3]。组织病理表现为角质形成细胞增殖和混合T淋巴细胞浸润[4-5]。T淋巴细胞亚群Th17细胞是近年发现的一种新型CD4+效应性T细胞，以其特征性的分泌IL-17而命名。由于其在银屑病等自身免疫性疾病中的免疫调节和致病性作用，已受到皮肤病等相关研究领域极大的关注。研究表明，Th17细胞参与了银屑病的发病[6-7]，其受到外来抗原刺激后，活化分泌一系列炎症性细胞因子，从而促进角质形成细胞增殖和皮肤炎症。中医学认为银屑病多是以 “血分有热”为主要病机特点，血热、血瘀、血燥证为其基本证候[8-9]，虽然在银屑病证候的研究中，学者们试图通过现代分子生物学技术揭示其微观实质，但仍处于探索中。本研究中，我们选择了T细胞中晚期免疫活化分子HLA-DR和增殖相关核蛋白Ki-67作为研究Th17细胞活化和增殖的观察指标，初步探讨其在银屑病血热证中的作用及与病情严重程度的关系，为银屑病血热证提供新的物质基础和辨证依据。

正常情况下单核细胞高表达Ⅱ类主要组织相容性(MHC)抗原HLA-DR。HLA-DR是单核巨噬细胞提呈外来抗原最重要的分子，在活化特异性T淋巴细胞进行免疫应答过程中具有关键性作用。CD4+T淋巴细胞通过其表面的TCR识别单核巨噬细胞表面HLA-DR分子与外来抗原肽形成的复合物，与之结合后提供第一刺激信号而启动T细胞活化增殖及特异性免疫应答。因此，单核细胞表面HLA-DR的表达和机体的免疫功能密切相关，也是银屑病发病机制的一个潜在因素。Ki67是增殖细胞表达的一种核抗原，最早是在增殖细胞中发现的，参与细胞的有丝分裂，是细胞增殖的重要标志物，也是目前众所周知的核增殖标志物。关于Ki-67的研究，目前从文献来看大多集中在肿瘤等增殖性疾病中，银屑病的表皮过度增殖伴角化不全，与细胞增殖和凋亡，细胞周期调控紊乱有关系。Ki-67在此方面的研究相对较少，基于上述认识，本课题研究小组尝试从Th17细胞的活化和增殖角度研究银屑病血热证的免疫发病机制。

由于Th17细胞没有特异性的标志，其主要分泌IL-17外，其他诸如NK，iNK，γδT等细胞也表达IL-17[10-11]，RORC2是其特异性的转录因子，对于标记Th17细胞具有重要作用。因此，本实验中，分别标记了这些细胞的表面标记，从而从多个产IL-17的T淋巴细胞中筛选出Th17细胞，进一步研究其活化状态和增殖程度。研究结果表明，血热证银屑病患者外周血Th17细胞表面活化相关分子HLADR和核内增殖蛋白Ki-67的表达均高于正常对照，说明血热证银屑病患者外周血中Th17细胞处于高活化状态，且增殖活跃，提示HLA-DR和Ki-67在银屑病血热证中具有重要作用，可能促使Th17细胞分泌下游的促炎症效应细胞因子 IL-17A、IL-17F、IL-21等，促进T淋巴细胞的有丝分裂，并能促进细胞由G1期向S期过渡，导致具有相同抗原特异性的细胞克隆扩增，大大增强了对特定抗原的免疫应答，引起机体的免疫损伤，或通过免疫炎症通路诱导角质形成细胞增殖，从而表现为角化亢进。有学者通过免疫组化和逆转录聚合酶链反应技术（RT-PCR方法）研究银屑病患者皮损中Ki-67的分布和Ki-67mRNA的表达，阳性细胞主要表达在基底细胞层和棘细胞层，且阳性率高于正常对照组，Ki-67mRNA的表达也显著高于正常表皮[12]，且Ki-67的表达与PASI呈正相关[13]。本实验结果部分与上述研究类似，但未发现Th17细胞的免疫活化分子HLA-DR和增殖蛋白Ki-67的表达与PASI呈相关性，可能与本研究样本量小，采血时间有关，和或在银屑病外周血和皮肤中，Ki-67的表达是否具有一致性有关，有待于进一步研究。

本研究的意义在于利用多色流式细胞仪进行检测和分析银屑病血热证患者外周血Th17细胞的活化和增殖状态，其中也检测了抑制性T细胞、NKT细胞、γδT细胞的活化与增殖，以进行不同产IL-17的T淋巴细胞的活化与增殖比较分析，数据未能在此显示。本研究给银屑病血热证的免疫发病机制和物质基础研究提供了新的理论依据和思路，同时对于银屑病血热证循环中活化和增殖的Th17细胞的理解，也将有助于银屑病的免疫调节治疗。

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（本文编辑 马 薇）

The Expression of Th17 Cells Activation and Proliferation Related Factors in Peripheral Blood of Patients with Blood-heat Syndrome of Psoriasis Vulgaris

TIAN Haigang1,WU Hounan2,WANG Jianfeng1,GUO Fuyun1,HUANG Binbin1,YANG Xufang3, MIAO Chaoyang4,ZHANG Xiaoyan5*
（1.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Cell Analytical Laboratory, Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China;3.Inner Mongolia Medical University, Hohhot,Neimenggu 010110,China;4.Peking University Health Science Center,Beijing 100083, China;5.Department of Dermatology,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China）

Objective To explore the role of Th17 cell activation and proliferation relatedfactors in the pathogenesis of psoriasis vulgaris of blood-heat syndrome and material foundation as well as dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris.Methods 12 patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris were enrolled from our hospital dermatology clinic, and 11 cases of healthy individuals as normal control.The expression level of Thl7 cells activation related factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with blood-heat syndrome of psoriasis vulgaris and healthy subjects were examined by multicolor flow cytometry.Results Thelevel of Thl7 cells activated factor HLA-DR in peripheral blood of patients was high expression compared with control group (11.686%±4.799%vs 8.016%±2.334%, P<0.05),the expression of proliferation factor Ki-67 was also increased compared to control group (8.727%±3.854%vs 5.665%±2.251%,P<0.05).But the activation factor HLA-DR,proliferation factor Ki-67 and psoriasis area and severity index(PASI)score did not show correlations(r1=0.021, r2=0.098,P>0.05).Conclusion The high expression of Th17 cell activation factor HLA-DR and proliferation factor Ki-67 in peripheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome, indicates theperipheral blood of patients with psoriasis of blood-heat syndrome-Th17 cells were at a high state of activation and proliferation.Both HLA-DR and Ki-67 may indirectly involved in the pathogenesis process of psoriasis of blood-heat syndrome.They are probably novel material foundations and dialectical basis of blood-heat syndrome of psoriasis.

psoriasis vulgaris;blood-heat syndrome;Th17cell;activation;proliferation

R758.63

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.07.010.039.05

2014－04－11

国家自然科学基金面上资助项目（81171502）。

田海刚，男，医学博士,主要从事中医药治疗银屑病疗效机制研究。

*张晓艳，女，主任医师，博士研究生导师，zhangxiaoyan2@medmail.com.cn。