链霉菌FIM-0916产安福霉素的发酵条件优化

杨煌建， 张祝兰， 黄小珍， 郑 卫*

1.福建微生物研究所，福州350007;

2.江苏康缘制药有限公司，江苏连云港222002

随着达托霉素(daptomycin)［1，2］的研发成功，环脂肽类抗生素的研究成为近年来研究的热点。安福霉素(amphomycin)［3］最早报道于20世纪50年代，但该化合物的化学结构直到2000年才最终确证，其化学结构与达托霉素相似，同属环脂肽类化合物［4］。研究表明，安福霉素具有良好的抗革兰氏阳性菌活性［5～7］。2011 年，Dominique 等［8］报道了安福霉素半合成衍生物MX-2401［9］的抗菌活性，MX2401对耐万古霉素肠球菌(简称VRE)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)等具有很好的抗菌能力，对支气管肺炎动物模型有更好的治疗作用。与达托霉素相比，MX2401具有更长的抗生素后遗效应和半衰期［9］，减少了给药次数，从而减小了药物毒性。MX2401及多个安福霉素衍生物已进入了临床前试验，具有广阔的研究开发前景。但目前国内对安福霉素的研究报道甚少。为获得安福霉素的高效发酵培养条件，本文对前期自然分离选育的安福霉素产生菌进行摇瓶发酵培养基组成及发酵参数的优化研究，以期为安福霉素的后续开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

链霉菌菌株Streptomyces canus FIM-0916由本课题组保存。

1.2 培养基

斜面培养基(ISP-2):酵母提取物4 g/L，麦芽提取物10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂 18.0 g/L。

种子培养基:蔗糖 30 g/L，KNO31 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母膏 2 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。

原始发酵培养基:黄豆粉10 g/L，葡萄糖10 g/L，NaCl 5 g/L，KNO31 g/L，CaCO31 g/L，pH 7.3 ～7.5。

1.3 主要试剂

安福霉素购自Sigma公司;甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉、棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、KNO3、FeSO4、ZnSO4、MgSO4、CaCO3和甘氨酸等14种氨基酸均为国产分析纯。

1.4 主要实验设备

摇床(太仓市科教器材厂，回转ZD8802C)，高效液相色谱分析仪(日本岛津，20A-DAD)。

1.5 摇瓶发酵培养

菌株斜面培养成熟后接种于种子培养基培养，种子培养液按1.0%的量加入发酵液中，三角瓶装液量为100mL/500mL，摇床转速250 r/min，培养温度28℃，培养时间120 h。

1.5.1 发酵培养基的优化 分别对发酵培养基中的碳源和氮源进行优化，碳源备选有甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖和麦芽糖，等量替代原始培养基中的葡萄糖作为碳源，比较安福霉素的发酵效价，确定最佳碳源。氮源备选有棉籽粉、酵母膏、牛肉膏和蛋白胨，等量替代原始培养基中的黄豆粉作为氮源，比较安福霉素的发酵效价，确定最佳氮源。

1.5.2 其他影响因素 分别考察培养基中添加不同氨基酸前体和无机盐对发酵的影响。氨基酸前体有14种，分别为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、络氨酸、组氨酸、色氨酸和脯氨酸。氨基酸前体的添加量为0.1%，以不添加氨基酸的原始发酵培养基为对照。考察5种无机盐，以原始发酵培养基中不加KNO3和CaCO3为对照，在对照配方上分别加入0.1%的 KNO3、FeSO4、Zn-SO4、MgSO4和 CaCO3，进行单因子试验。

1.5.3 正交试验 以实验确认的碳源、氮源、氨基酸前体和无机盐为四因素，设计四因素三水平L9(34)正交试验(见表1)，确定最佳培养基配方。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 The factors and levels for the orthogonal design.

1.5.4 发酵条件的优化 分别考察种龄(30 h、42 h、48 h、54 h、65 h、72 h 和 78 h)、接种量(0.5%、1%、1.5%、2%、5%和 10%)、装液量(每500mL 摇瓶中装液 60mL、80mL、100mL、120mL和150mL)、发酵周期(72 h、96 h、120 h、144 h 和168 h)和温度(22℃、26℃、28℃、30℃和35℃)对发酵的影响。

1.6 发酵液中安福霉素效价测定

采用HPLC法分析发酵液中安福霉素效价。HPLC 条件:色谱柱，ODS C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流速 1mL/min;柱温 40℃;检测波长200 nm;流动相为44%乙腈/水(含0.1%三氟乙酸，V/V)。样品制备:发酵液过滤，滤液经10 000 r/min离心10min，取上清液即为测定液。标准曲线的绘制:取安福霉素对照品约49.30 mg，精密称定，置25mL量瓶中，用超纯水溶解并定容，摇匀，制成浓度为1.972 mg/mL的标准储备溶液。将安福霉素对照品标准储备溶液以超纯水稀释，制成 0.049 mg/mL、0.099 mg/mL、0.197 mg/mL、0.395 mg/mL、0.986 mg/mL、1.972 mg/mL 系列标准溶液。在上述色谱条件下进行HPLC分析。以安福霉素浓度(mg/mL)为横坐标，安福霉素峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y=20 000 000X －658 392，R2=0.999 1。根据样品峰面积/标准液峰面积 ×标准液浓度计算效价。

1.7 发酵实证

采用最佳发酵培养基配方和优化后发酵条件进行发酵试验，考察安福霉素的最终发酵效价。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基配方的优选

2.1.1 碳源的选择 参考 Heinemann B等［10］专利报道的发酵培养基设置原始发酵培养基成分，并设为对照培养基(发酵液中安福霉素相对效价设为100)，分别使用甘油、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、麦芽糖作为碳源以相同比例替代原始培养基中的碳源(葡萄糖)进行摇瓶发酵，考察不同碳源对安福霉素效价的影响。结果如图1，以蔗糖作为碳源，安福霉素的效价有显著的提高。因此，优选蔗糖作为发酵培养基的碳源。

图1 不同碳源对安福霉素发酵水平的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on amphomycin production.

2.1.2 氮源的选择 以原始发酵培养基为对照培养基(安福霉素相对效价100)，分别使用棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨作为氮源以相同比例替代原始培养基中的氮源(黄豆粉)进行摇瓶发酵，考察不同氮源对安福霉素产量的影响，结果如图2。以黄豆粉作为氮源，安福霉素的效价较高，而棉籽粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨4种氮源对安福霉素的产量提高没有明显作用。因此，优选黄豆粉作为发酵培养基的氮源。

图2 不同氮源对安福霉素发酵水平的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources on amphomycin production.

2.1.3 氨基酸前体对发酵的影响 以甘氨酸等14种氨基酸作为前体，在发酵培养基中各加入至终浓度为0.1%(V/V)，考察其对安福霉素生物合成的影响，结果如图3所示。添加精氨酸、组氨酸、脯氨酸的发酵液安福霉素效价比无氨基酸前体添加的空白对照提高20%以上，添加谷氨酸以及酪氨酸对安福霉素合成的影响不大，添加甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸等对安福霉素的合成有抑制作用。因此，优选组氨酸作为前体加入发酵培养基。

图3 氨基酸对对安福霉素发酵水平的影响Fig.3 Effects of Amino acids on amphomycin production.

2.1.4 无机盐的影响 在发酵培养基中分别加入 0.1% 的 KNO3、FeSO4、ZnSO4、MgSO4和 CaCO3，比较上述5中无机盐的添加对发酵效价的影响，结果见图4。不同无机盐的添加对安福霉素合成能力影响不同，其效果从高到低排序为KNO3＞CaCO3＞MgSO4＞FeSO4＞ZnSO4，添加 KNO3可提高安福霉素产量水平50%以上，CaCO3可提高20%安福霉素产量，添加MgSO4后安福霉素产量略有提高，FeSO4和ZnSO4会降低安福霉素的产量。因此，综合考虑可选择KNO3和CaCO3作为培养基优化配方中的无机盐组分。

图4 无机盐对对安福霉素发酵水平的影响Fig.4 Effects of inorganic salts on amphomycin production.

2.1.5 发酵培养基正交试验 根据上述实验结果，选择蔗糖、黄豆粉、组氨酸和KNO3作为发酵培养基组成成分，设计L9(34)正交试验综合考察培养基各成分对产安福霉素的影响，结果见表2。根据正交设计助手软件分析，对产安福霉素的影响主次顺序为:B＞A＞D＞C，即黄豆粉＞组氨酸＞KNO3＞蔗糖。其优势组合为A1 B2 C2 D1，即得到合适的培养基配方为:蔗糖1.5%，黄豆粉1.0%，组氨酸 0.1%，硝酸钾 0.1%。

表2 正交试验结果Table 2 The results of L9(34)orthogonal test.

2.2 摇瓶发酵条件的优化

2.2.1 种龄对发酵的影响 种龄的控制是发酵能否正常进行的关键因素之一。在工业发酵生产中，最适种龄一般都选在菌种对数生长期。图5显示，种龄54 h时，安福霉素效价最高。

图5 不同种龄对安福霉素效价的影响Fig.5 Effects of different cultivation time of seed on amphomycin production.

2.2.2 接种量对发酵的影响 在发酵过程中，接种量的大小是由菌体的生长繁殖速度决定的，也是保证发酵正常进行的一个关键因素。图6显示，接种量2%时，安福霉素发酵效价最高。

图6 不同接种量对安福霉素效价的影响Fig.6 Effects of different inoculum size on amphomycin production.

2.2.3 装液量对发酵的影响 结果如图7所示，安福霉素的产量随着装液量的增加而提高，但考虑到装液量过多易造成染菌，故选择装液量120mL作为最佳条件。

2.2.4 发酵周期对发酵的影响 抗生素产生菌在发酵过程中，抗生素的产率与发酵周期密切相关。图8显示，该链霉菌产安福霉素效价在发酵120 h左右达到最高。

图7 不同装液量对安福霉素效价的影响Fig.7 Effects of different medium volume on amphomycin production.

图8 发酵周期对安福霉素效价的影响Fig.8 Effects of fermentation time on amphomycin production.

2.2.5 发酵温度对发酵的影响 微生物有其最适和耐受的温度范围，同一种微生物在不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，最适温度往往也不相同。由图9可知，温度为28℃时，链霉菌产安福霉素的产量最高，因此最宜的发酵温度为28℃。

图9 发酵温度对安福霉素效价的影响Fig.9 Effects of fermentation temperature on amphomycin production.

2.3 优化发酵条件的验证

在综合最优条件下，对链霉菌菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916进行5批发酵验证试验，结果显示在最佳培养基配方和优化发酵条件下，发酵液相对效价分别为 367.3、301.3、400.1、356.2 和313.0，平均相对效价347.6，发酵水平提高了248%以上。优化发酵培养基成效较显著，优化发酵条件下的发酵液中安福霉素产量显著提高。

3 讨论

高产菌株的特性不仅由其遗传特性决定，而且也由其所处的环境条件和菌体生长变化决定。发酵法生产次级代谢物除了受菌种的影响外，培养基的组成、培养条件等对产量影响也很大。在生产上，有了优良的菌种后，还需要有最佳的环境条件即发酵工艺加以配合。否则，即使有了优良菌种，菌种的生产能力也不能充分体现。因此，探索菌株高产特性充分表达的最佳培养条件是发酵生产的基础与关键。

安福霉素是近年来研究较多的环脂肽类化合物，据报道其发酵水平较低，国内也没有安福霉素发酵相关的报道，本实验室前期通过对链霉菌(Streptomyces canus sp.)进行菌种筛选，获得了一株遗传稳定的高产菌株 Streptomyces canus sp.FIM-0916，本文对其发酵培养基和摇瓶发酵条件进行了考察。实验结果显示该菌株对于胨类或提取物类等水解完全的氮源利用率较差，而对黄豆粉这一粗放氮源利用率较好，可能是较为粗放的氮源含有不同水解程度的蛋白质和氨基酸等，对于其后期次级代谢合成目标产物有不同程度的影响;不同碳源对该菌株发酵产安福霉素的影响较大，可能是其发酵前期对于不同碳源组成的利用能力的差别，导致菌体生长速度的不同，从而引起后期次级代谢产物合成发酵结果的不同，实验结果显示蔗糖的利用效果最佳，明显好于文献报道［10］的葡萄糖。在微生物发酵研究中发现，适当补加氨基酸可以增加相应目标产物的产量［11，12］。本实验亦证明，链霉菌菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916生物合成安福霉素过程中，添加适量的精氨酸、组氨酸和脯氨酸对产安福霉素均有促进作用，其原因可能是这几种氨基酸通过特定代谢途径产生目的代谢途径中所需的辅酶或中间代谢物包括前体物，抑制或激活相关代谢途径中关键酶的活性，从而促进目的代谢产物产量的提高［13，14］。无机盐类是微生物生长不可缺少的营养物质，通过调节培养基中的无机盐成分，可提高抗生素的产率［15］。本实验显示，添加适宜的KNO3和CaCO3对产安福霉素均有促进作用，其原因可能是通过调节培养基的渗透压、pH等，促进该菌株生物合成目标产物。

通过单因素试验结果分析，进一步结合正交试验优化，本文考察了链霉素菌株Streptomyces canus sp.FIM-0916的发酵条件，最终筛选获得了适宜的发酵培养基组成:蔗糖1.5%，黄豆粉1.0%，组氨酸 0.1%，KNO30.1% 和 CaCO30.1%;确定了最佳发酵条件:种子菌龄 54 h，装液量120mL/500mL，接种量2%，发酵温度28℃，摇床转速250 r/min;最佳发酵时间为5 d。该菌株优化后的摇瓶发酵条件与初始条件相比，安福霉素的发酵单位提高了3.5倍。通过对培养基组成的研究和发酵参数的优化，不仅在如何提高安福霉素产量上有了更加深入的认识，也为安福霉素发酵工业化生产奠定了基础。影响链霉菌(Streptomyces canus sp.)生产次生代谢物的因素很多。产物的诱导或抑制，菌体分散成菌丝或聚集成团与产物合成之间的关系，以及生长因子或表面活性剂对生物合成目标产物的影响等，均有待深入地研究。

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