穴位埋线对失眠大鼠下丘脑单胺类递质及IL-1b、TNF-a含量的影响

郭爱松,刘春,李百胜,朱振杰,陈伟观,李爱红



穴位埋线对失眠大鼠下丘脑单胺类递质及IL-1b、TNF-a含量的影响

郭爱松1,刘春2,李百胜2,朱振杰1,陈伟观1,李爱红1

(1.南通大学附属医院,南通 226001;2.南通大学,南通 226001)

观察穴位埋线对失眠大鼠下丘脑组织中单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)及细胞因子白细胞介素-1b(IL-1b)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)含量的影响,探讨穴位埋线治疗失眠的作用机理。将40只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、安定组、针刺组和埋线组,每组8只。实验第1天,应用对氯苯丙胺酸(PACA)制作失眠大鼠模型。实验第3天开始,安定组用安定注射液腹腔注射治疗,每日1次,连续5 d;针刺组用毫针针刺治疗,每日1次,连续5 d;埋线组用穴位埋线治疗1次。各组均于实验第7天治疗后1 h处死大鼠取下丘脑组织,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组下丘脑组织中5-HT、DA、NE及IL-1b、TNF-a含量。实验第7天,模型组大鼠下丘脑组织中5-HT及IL-1b、TNF-a含量明显低于空白对照组,DA、NE含量高于空白对照组,差异均具有统计学意义(＜0.05)。与模型组比较,安定组、针刺组、埋线组5-HT含量均升高,DA、NE含量均降低,差异均具有统计学意义(＜0.05);安定组、针刺组、埋线组之间比较,埋线组下丘脑5-HT及DA、NE含量改变情况优于安定组及针刺组(＜0.05),安定组和针刺组之间比较差异均无统计学意义(＞0.05)。与模型组比较,针刺组和埋线组IL-1b、TNF-a含量均升高,埋线组优于针刺组(＜0.05)。穴位埋线改善失眠的作用机制可能与调节下丘脑组织单胺类神经递质5-HT、DA、NE及细胞因子IL-1b、TNF-a含量有关。

针刺疗法;穴位疗法;埋线;失眠症;单胺类神经递质;白细胞介素-1b;肿瘤坏死因子-a;大鼠

失眠症是指患者对睡眠时间和(或)质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验。随着经济和社会的发展,人们的生活和工作压力不断增大,失眠的患病率有不断增加的趋势,已成为严重影响人们生活质量、人际交往和导致工作效率下降的重要因素,失眠的治疗方法及机制已成为目前医学界重要的研究课题。有研究[1-3]认为,针刺具有增加失眠患者睡眠时间,改善睡眠质量、睡眠结构等作用,针刺的方法主要运用传统体针法、头皮针法等,这些针刺方法主要利用反复多次的针刺方式刺激经穴取得治疗效果,疗效持续时间短、患者的依从性不好,这在一定程度上影响了针刺治疗失眠的临床疗效。

穴位埋线采用穴位线体植入的方式,借助埋入线体对穴位持续刺激作用替代传统针刺,这不仅是传统针具的革新,同时也是治疗模式的重大改进,埋线疗法使针刺治疗从短效反复治疗模式发展到了长效治疗模式,尤其用于治疗失眠等慢性顽固性疾病[4-6]。研究发现单胺类神经递质及细胞因子参与睡眠的调节,本实验通过检测下丘脑单胺类神经递质5-羟色胺(5- HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)及细胞因子白细胞介素-1b(IL-1b)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)含量的影响,探讨穴位埋线治疗失眠的作用机理,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年大鼠40只,雌雄各半,质量180～200 g,由南通大学实验动物中心提供[实验动物生产许可证SCXK(苏)2008-0010]。在相同条件下分笼饲养,自然光照,动物房内温度(20±3)℃,相对湿度为40%～60%,适应性喂养7 d后,随机分为空白对照组、模型组、安定组、针刺组、埋线组,每组8只。

1.2 动物模型制备

参照文献[7],采用对氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射的方法,PCPA为美国Sigma公司产品(批号Cas14173 -39-8)。PCPA临用前按大鼠300 mg/kg用量,用弱碱性生理盐水配置成混悬液备用(30 mg/100 mL),腹腔注射PCPA混悬液(1 mL/100 g)。实验第1天注射1次,连续2 d。于第1次腹腔注射24～28 h后,动物出现昼夜节律消失,活动不停,表明模型复制成功。

1.3 处理方法

①空白对照组不造模,自然喂养及活动。②模型组于实验第1天开始造模,造模成功后,实验第3天开始同空白对照组。③安定组于实验第1天开始造模,造模成功后,实验第3天开始给予地西泮(安定)注射液腹腔注射治疗。给药剂量按成人催眠剂量10 mg/d,用人鼠给药剂量体表面积折算公式计算出大鼠给药剂量为每日0.92 mg/kg。每日1次,连续治疗5 d。④针刺组于实验第1天开始造模,造模成功后,实验第3天给予毫针针刺治疗,穴位处方为神门、三阴交、百会(取穴参照人体有关穴位及动物取穴方法[8])。针刺方法为每日下午4～6时,将大鼠捆绑于自制的大鼠针刺用固定器中,采用0.35 mm×25 mm毫针行手针刺激。针刺百会向前斜刺百会穴约1 cm,直刺神门、三阴交穴约0.5 cm,留针20 min。每日治疗1次,连续5 d。⑤埋线组于实验第1天开始造模,造模成功后,实验第3天开始穴位埋线治疗1次,埋线穴位同针刺组,埋线针具为一次性使用无菌1 mL注射器针尖及一次性使用无菌0.35 mm×25 mm毫针。穴位埋线根据穴位的可刺深度,先将无菌4/0号0.5～1 cm长度医用羊肠线放入1 mL注射器针尖内,穴位局部消毒后绷紧皮肤,将针头刺入穴位,深度和针刺组相同,再用毫针将医用羊肠线推入穴位内后按压针孔。

1.4 标本及检测

各组于实验第7天,治疗后1 h,断头处死大鼠,在枕骨大孔处迅速剪断延髓,去颅骨,完全暴露脑组织,取出脑组织,在冰冷平皿上去大脑、小脑,将分离出的下丘脑在冰冷生理盐水中洗去血液,滤纸拭干称重,加入一定量PBS液(pH值为7.2～7.4)后,用液氮迅速冷冻备用。标本融化后,按20:1加入PBS液,用匀浆器将标本匀浆充分,离心20 min(2000～3000转/min),收集上清。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定5-HT,DA,NE 及IL-1b、TNF-a含量,试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供,由专人按说明书操作。

1.5 统计学方法

所有数据结果均采用SPSS11.0统计软件进行统计分析,数据采用均数±标准差表示,采用检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠自发行为的影响

正常大鼠在连续以300 mg/kg的PCPA腹腔注射2 d后,睡眠-觉醒的昼夜节律消失,说明模型复制成功。行为学表现为大鼠正常的睡眠活动消失,白天也活动不停,且容易激惹。经过安定、针刺及穴位埋线干预后大鼠的睡眠-觉醒节律开始恢复,白天活动少,安静、蜷卧、不易被外界惊醒,埋线组大鼠失眠改善尤为明显,模型组大鼠失眠无明显改善。

2.2 各组大鼠下丘脑单胺类递质的含量比较

实验第7天,模型组大鼠下丘脑组织中5-HT的含量明显低于对照组,DA、NE高于对照组,差异均具有统计学意义(＜0.05);安定组、针刺组、埋线组5-HT的含量均升高,DA、NE均降低,与模型组比较差异均有统计学意义(＜0.05);安定组、针刺组、埋线组之间比较,埋线组优于安定组及针刺组(＜0.05),安定组和针刺组之间比较差异均无统计学意义(＞0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠下丘脑单胺类递质的含量比较 (±s,ng/L)

注:与空白对照组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与埋线组比较3)＜0.05

2.3 各组大鼠下丘脑IL-1b、TNF-a含量比较

实验第7天,模型组大鼠下丘脑组织中IL-1b、TNF-a的含量明显低于对照组。与模型组比,安定组IL-1b、TNF-a含量差异无统计学意义(＞0.05),针刺组、埋线组的IL-1b、TNF-a含量均升高,差异均具有统计学意义(＜0.05),埋线组优于针刺组(＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠下丘脑IL-1b、TNF-a含量比较 (±s,ng/L)

注:与空白对照组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与针刺组比较3)＜0.05

3 讨论

失眠,中医学亦称之为“目不暝”、“不得眠”或“不寐”,多因饮食不节、情志失常、劳逸失调及病后体虚所致心胆脾肾的阴阳失调,气血失和。病理性质总属阳盛阴衰、阴阳失交,一为阴虚不能纳阳,一为阳盛不得入于阴,病位主要在心,并与肝脾肾相关。现代医学认为失眠原因较多,有社会环境、心理生理及躯体等因素,发生机制与中枢神经系统众多的神经网络和一系列神经介质、神经内分泌和神经调节物质有关。

研究发现单胺类神经递质及细胞因子IL-1b、TNF-a等参与睡眠机制的调节。单胺类神经递质主要包括5-HT和儿茶酚胺,后者主要指DA、NE和肾上腺素。5-HT是目前较为公认的参与睡眠-觉醒机制的经典神经递质,被认为是脑内的“致眠因子”,对慢波睡眠的发生和维持起着重要作用。DA在脑内主要起兴奋作用,对睡眠具抑制作用,NE作为脑干网状结构上行激动系统的重要部分,主要与快速动眼相(REM)睡眠及觉醒的维持有关[9]。在中枢神经系统内5-HT、DA及NE能神经元数量较少,其胞体大多聚集于脑干离散区域,形成集群或核团;但是其轴突分布广泛,可支配脑的所有区域,能通过同时调制中枢神经系统广泛区域的突触活动而调控脑的总体功能,下丘脑内存在“睡眠中枢”和“觉醒中枢”,下丘脑与脑干处的相关区域相互作用,共同完成睡眠与觉醒的调节[10-11]。

细胞因子不但是重要的免疫调节因子,而且具有广泛的中枢调节作用,研究表明细胞因子IL-1、TNF能通过不同线路影响中枢神经系统的睡眠过程。外源性补充(静脉或脑室注射)IL-1后,可增加大鼠、小鼠及猴等的非快速动眼(NREM)睡眠时间;反之,若用抑制IL-1生成的物质或IL-IR拮抗剂或IL-1抗体抑制内源性IL-1活性作用,可抑制自发性睡眠,并可抑制睡眠剥夺后的睡眠反弹。IL-1分子结构可分为IL-1a和IL-1b两种形式,IL-1b在脑内分布较为广泛,IL-1b可调节大鼠下丘脑前区NE、5-HT和DA的释放,通过促进慢波睡眠,参与睡眠调节[12]。TNF参与NREM睡眠的调节,外源性补充TNF可使大鼠、小鼠及兔的NREM睡眠增加,其促进睡眠机制在于TNF可增加脑中5-HT及其代谢产物5-羟吲哚乙酸的含量,增强中枢5-HT系统的功能。此外,TNF与IL-1对睡眠的调节有密切关系,有许多刺激因素可同时诱导两者的释放,而TNF与IL-1还能够互相诱导对方的产生,在睡眠调节中,两者似乎来源于同一个功能性基因组[13-14]。

本实验通过腹腔注射PCPA复制大鼠失眠状态, PCPA失眠鼠模型是目前公认的,并广泛用于5-HT及其与其他递质之间关系研究的经典动物模型[7]。本实验结果显示,模型组大鼠下丘脑组织中5-HT、IL-1b、TNF-a的含量明显低于对照组,DA、NE高于对照组,差异均具有统计学意义(＜0.05),说明PCPA造模后,影响了下丘脑单胺类神经递质5-HT、DA、NE及细胞因子IL-1b、TNF-a的分泌,故5-HT、DA、NE及IL-1b、TNF-a含量失调成为大鼠失眠的原因之一。与模型组比,经过安定、针刺、穴位埋线治疗后3组5-HT的含量均升高,DA、NE均降低,差异均具有统计学意义(＜0.05),埋线组5-HT、DA、NE的改变情况优于安定组及针刺组(＜0.05);与模型组比,安定组IL-1b、TNF-a含量无明显变化(＞0.05),而针刺组及埋线组IL-1b、TNF-a含量增高,且埋线组优于针刺组(＜0.05)。表明应用安定、针刺、埋线均能调节单胺类递质的分泌平衡,抑制觉醒和兴奋促进睡眠,调节睡眠-觉醒周期平衡。另外,针刺及穴位埋线能够调节睡眠相关细胞因子含量从而调节睡眠,从而提示针刺、埋线治疗失眠可以针对失眠的多种因素,具有整体调整、多靶点治疗优点。

研究发现,穴位埋线疗效优于针刺治疗,这可能与穴位埋线的治疗特点有关。穴位埋线疗法是在中医学经络理论的指导下,用特制的医疗器具将医用羊肠线埋入相应穴位区域,通过针具和羊肠线在穴位内产生刺激,产生较一般针刺方法更为强烈而持久的针刺效应。羊肠线作为一种异体蛋白埋入机体后,逐渐被机体软化吸收,起组织疗法的作用,且刺激持久,能更好地调节机体内环境的相对平衡,提高机体的调节能力。埋线主穴取神门、三阴交、百会。神门为心经原穴,心主血脉、藏神,取之可养血宁心、安神定志。三阴交穴与神门相配则具有镇静安神作用,对失眠有良好的治疗作用百会属于督脉穴,位于巅顶,联系脑,是调节大脑功能的要穴,临床常用于治疗失眠及各种神志病。诸穴配伍,共同发挥镇静安眠、协调阴阳、标本兼治的作用。在临床失眠的治疗中,穴位埋线具有使用简便、疗效好、无副反应等优点,越来越受到患者欢迎[5]。本研究结果表明,穴位埋线治疗失眠的机理可能与增加下丘脑中枢单胺类神经递质5-HT及细胞因子IL-1b、TNF-a含量,降低DA及NE含量有关。

[1] 失眠定义、诊断及药物治疗共识专家组.失眠定义、诊断及药物治疗共识专家共识(草案)[J].中华神经科杂志,2006,39(2):141- 143.

[2] 周章玲,石现,李绍旦,等.头穴透刺对失眠患者睡眠质量与睡眠结构的影响[J].中国针灸,2010,30(9):721-724.

[3] 任珊.针刺对失眠症患者PSQI量表影响的临床观察[J].新中医, 2011,43(5):109-110.

[4] 孙文善.微创埋线:技术现状与发展趋势[J].中医外治杂志,2008, 17(2):3-5.

[5] 郭爱松,李爱红,冯兰芳,等.穴位埋线结合药物治疗老年性失眠的疗效[J].中国老年学杂志,2011,31(23):4568-4570.

[6] He XP. Clinical study on thread-embedding therapy for insomnia due to heart-spleen deficiency[J]. J Acupunct Tuina Sci,2012,10(4):223-226.

[7] 肖成荣,马增春,李海静,等.PCPA失眠大鼠模型的制作及其机制[J].毒理学杂志,2007,2l(4):326.

[8] 李辞蓉,华兴邦,周浩良,等.豚鼠针灸穴位图谱的研制[J].上海针灸杂志,1992,11(2):28-30.

[9] 江帆,颜崇淮,沈晓明.与睡眠相关的中枢单胺类递质[J].国外医学:精神病学分册,2001,28(1):55-58.

[10] 宋媛,赵仓焕,任莉.不同穴位处方麦粒灸对失眠大鼠下丘脑单胺类神经递质的影响[J].暨南大学学报:自然科学与医学版,2009, 30(2):185-188.

[11] 刁远明,陈群.安寐汤对失眠大鼠脑组织多巴胺含量的影响[J].中国医药导报,2011,8(17):105-107.

[12] 王红丹,全世建,盛亚男.交泰丸对对氯苯丙胺酸致失眠大鼠血清细胞因子的影响［J］.广州中医药大学学报,2008,25(6):525-527.

[13] 陈利华,胡幼平,罗荣.电针百会、三阴交对大鼠睡眠剥夺细胞因子的影响[J].上海针灸杂志,2009,28(11):678-681.

[14] 赵仓焕,任莉,宋媛.不同穴位处方电针对失眠大鼠下丘脑IL-1b、TNF-a及IL-6的影响[J].暨南大学学报:医学版,2008,29(2):177 -180.

Effect of Acupoint Catgut Embedding on Hypothalamic Monoamine Neurotransmitter, IL-1band TNF-aContents in Insomnia Rats

-1,2,-2,-2,-1,-1.

1.,226001,; 2.,226001,

To investigate the effect of acupoint catgut embedding on hypothalamic monoamine neurotransmitters 5-hydroxytryptamine (5-HT), dopamin (DA) and norepinephrine (NE), and cytokine interleukin-1b(IL-1b) and tumor necrosis factor-a(TNF-a) contents in insomnia rats and explore the mechanism of acupoint catgut embedding treatment for insomnia.Forty SD rats were randomly allocated to blank control, model, diazepam, acupuncture, catgut embedding groups, 8 rats each. On the first day of experiment, a rat model of insomnia was made with para-chlorophenylalanine (PCPA). From the third day of experiment, the diazepam group was intraperitoneally injected with diazepam once daily, for five consecutive days; the acupuncture group was treated with filiform needle acupuncture once daily, for five consecutive days; the catgut embedding group was treated by acupoint catgut embedding for one time. On the seventh day of experiment, the rats of every group were sacrificed and the hypothalami were taken at one hour after treatment. Hypothalamic 5-HT, DA, NE, IL-1band TNF-acontents were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in every group.On the seventh day of experiment, hypothalamic 5-HT, IL-1band TNF-acontents were significantly lower and DA and NE contents were higher in the model group of rats than in the blank control group; there were statistically significant differences (＜0.05). The 5-HT content increased and the DA and NE contents decreased in the diazepam, acupuncture and catgut embedding groups compared with the model group (＜0.05). Changes in hypothalamic 5-HT, DA and NE contents were more marked in the catgut embedding group than in the diazepam and acupuncture groups (both＜0.05) and there were statistically significant differences between the diazepam and acupuncture groups (＞0.05). The IL-1band TNF-acontents increased in the acupuncture and catgut embedding groups compared with the model group and increased more in the catgut embedding group than in the acupuncture group (＜0.05).The mechanism by which acupoint catgut embedding improves insomnia may involve its regulation of hypothalamic monoamine neurotransmitters 5-HT, DA and NE, and IL-1band TNF-acontents.

Acupuncture therapy; Acupoint therapy; Acupoint catgut embedding; Insomnia; Monoamine neurotransmitters; Cytokine interleukin-1b; Tumor necrosis factor-a; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.07.0672

江苏省南通市社会发展科技计划项目(S2010006)

郭爱松(1971 - ),男,副主任医师,硕士生导师

李爱红(1970 - ),女,主任医师,E-mail:liaihongbox@ 163.com

1005-0957(2014)07-0672-04

2013-12-14