荧光增敏法测定咽炎片中丹皮酚的含量*

(泰山医学院化工学院,山东 泰安 271016)

咽炎片由玄参、百部、天冬、牡丹皮等12味药组成，具有养阴润肺、清热解毒、清利咽喉、镇咳止痒的功效，丹皮酚为主药牡丹皮的有效成分，是一种小分子的酚类化合物，呈白色针状结晶，其化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，具有良好的解热、镇痛、抗菌和抗炎作用[1]。目前检测丹皮酚的方法有紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3-5]、气相色谱法[6]、电化学方法[7]等。为有效地控制制剂质量，本实验基于AlCl3试剂对丹皮酚具有荧光增敏作用，建立了丹皮酚含量测定的荧光分析法，并成功用于咽炎片中丹皮酚含量的测定。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好、结果准确, 适合作为该品种的测定方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

RF-5301荧光分光光度计(日本岛津)； UV-5300紫外分光光度计；FC204型电子天平；pHS23C型酸度计。

丹皮酚溶液：称取0.0033 g丹皮酚标准品(中国药品生物制品检定所，批号110708-200505)，用少量甲醇溶解后转移至100 ml容量瓶中，定容，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成0.33 μg/ml的溶液，吸取1.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，配成3.3×10-3μg/ml的溶液；AlCl3溶液：称取6.60 g AlCl3(分析纯)，置于小烧杯中，加适量水溶解后转移至100 ml容量瓶中，定容，配成0.50 mol/L的标准溶液；磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液：分别配成0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液和0.3 mol/L的磷酸二氢钠溶液，按不同的比例配成pH 5.8～8.0的一系列缓冲溶液。

试验用水均为二次蒸馏水。

1.2 试验方法

于10 ml比色管中，依次加入0.50 mol/L AlCl3溶液1.00 ml，适量的丹皮酚溶液， 1.00 ml pH 7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，用二次水定容至10 ml。室温放置5 min，于λem= 455 nm处测定其与试剂空白的荧光强度(λex= 295 nm)。测定体系荧光强度F与试剂空白的荧光强度F0，计算ΔF=F0- F。

2 结果与讨论

2.1 紫外吸收光谱

考察了丹皮酚及其与Al( Ⅲ)相互作用的紫外吸收光谱，实验发现，丹皮酚的最大吸收峰为275 nm，加入铝离子其最大吸收峰红移至295 nm，但其吸收强度变化不大，如图1所示。这种现象表明丹皮酚与Al( Ⅲ )发生了反应，生成了新的配合物。

2.2 荧光光谱

考察了丹皮酚及其与Al( Ⅲ)相互作用的激发光谱和荧光光谱，实验发现，丹皮酚自身的荧光强度很弱，但加入Al( Ⅲ )后其荧光强度显著增强，如图2所示。实验表明，其最大激发波长为295 nm，最大发射波长为455 nm，且在455 nm处荧光强度F值在一定范围内与加入的丹皮酚浓度成比例，随着丹皮酚浓度增大，荧光强度增强。

图1 丹皮酚及丹皮酚-铝( Ⅲ)配合物的紫外吸收光谱

图2 丹皮酚及丹皮酚-铝( Ⅲ )配合物的荧光发射光谱曲线

1: 3.3 ×10-4μg/ml paeonol; 2: 1.32×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 3: 1.98×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 4: 2.64×10-4μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 5: 3.30×10-3μg/ml paeonol + 0.05 mol/L AlCl3; 6: 3.96×10-3μg/ml paeonol + 0.05mol/L AlCl3

2.3 AlCl3用量的选择

在实验条件下，固定丹皮酚的浓度，考察了AlCl3用量对荧光强度的影响。实验发现AlCl3溶液用量在0.60～1.50 ml范围内体系荧光强度增大值ΔF有较大值且稳定。本实验选择0.50 mol/L AlCl3溶液用量为1.00 ml。

2.4 酸度的影响及其用量

溶液酸度影响配合物的稳定性，进而影响其光谱性质。向体系中加入不同pH的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，按实验方法，分别测定含Al(Ⅲ)体系与空白体系的荧光强度值F和 F0，得到荧光强度差值ΔF。结果表明，在pH 6.6～7.4之间荧光强度增大值ΔF有较大值且稳定。因此选择pH 7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液来控制体系的酸度。本实验选用1.00 ml缓冲液为进一步实验的最佳条件。

2.5 反应温度及时间的影响

本体系的反应在室温下能迅速完成，且升高温度对荧光强度猝灭值无太大影响，室温下荧光强度在10 h内基本恒定。

2.6 工作曲线与检出限

在最佳试验条件下，测定了丹皮酚标准系列溶液的荧光强度。以荧光增大值ΔF对其质量浓度绘制工作曲线。得到丹皮酚的线性回归方程为ΔF =89.45ρ(×10-3μg/ml)- 0.2777，线性范围为1.3 ×10-4～ 7.3 ×10-4μg/ml，相关系数r=0.999，检出限(3s/k)为0.8 ×10-4μg/ml。

2.7 共存离子的影响

在最佳实验条件下，丹皮酚浓度为3.3×10-4μg/ml，相对误差不大于±5.0%时，可允许的共存物质量(以mol/L计)为：K+(1.0)，Ca2+(0.8)，Mg2+(1.2)，Zn2+(0.5)，Ni2+(0.1)，Cu2+(0.05)，Mn2+(0.4)；Cd2+(0.2)；Hg2+(0.02)，Cr3+(0.06)，Fe3+(0.002)。

3 样品的测定

取10片咽炎片，除去包衣，精密称重2.391 g，取2.00 g放入蒸馏烧瓶中，浸泡3 h加0.12 g NaCl，控制温度在100℃蒸馏，收取50 ml馏分，再加少许水进行二次蒸馏，合并馏分，转移至100 ml容量瓶中，定容。经适当稀释后用本实验方法进行测定，同时做标准加入回收试验，结果见表1。

表1 样品测定结果(n=6)

[1] 吕成明,刘海燕. 丹皮酚的药理作用研究进展[J].医药导报, 2005, 24(2):142-143.

[2] 高锦红. 六味地黄丸中丹皮酚含量的测定[J]. 江苏农业科学,2013,41(1):293-294.

[3] 孔永红,康红钰.HPLC法测定金嗓清音丸中丹皮酚的含量[J].中国药房,2011,22(8):749-750.

[4] 冯发青,王恩源,伍庆,等. HPLC 法同时测定麦味地黄胶囊中马钱苷、芍药苷和丹皮酚[J].中成药,2012,34(12):2339-2342.

[5] 李冰,王瑜. HPLC 测定茂丹皮中的丹皮酚[J].华西药学杂志,2010, 25 (5) :609-610.

[6] 袁杰.气相色谱法测定丹皮酚软膏中丹皮酚的含量[J].现代中药研究与实践, 2008, 22( 2 ) : 43-44.

[7] 吴剑, 李端, 张叶,等. 丹皮酚软膏中的丹皮酚的超微电极快速扫描法检测[J]. 药物分析，2010, 30(12): 2369-2371.