二阶导数示波极谱检测人血清中NO2-含量方法的建立*

杨 静 吴 刚 王登奎 张丽萍 张永梅 张桂莲

(1.包头医学院基础学院， 2.包头医学院药学院，3.包头医学院公共卫生学院，内蒙古 包头 014060，4.包头医学院第一附属医院检验科，内蒙古 包头 014010)

体内NO的产生和释放异常可能与多种疾病的发生、发展有关，如急性肺损伤、缺血缺氧性脑损伤等[1-2]，现在的研究大多以测定体液和组织中NO的代谢产物亚硝酸根(NO2-)含量来反映体液和组织中NO含量。目前较多的是采用测定灵敏度较高的偶氮染料比色法测定血清中NO2-和NO3-总量以间接测定NO的含量[3-5]，但偶氮染料比色法主要应用的试剂为α-萘胺，长期使用会造成环境的污染。目前有国内学者利用二阶导数极谱仪进行了对磺胺和盐酸萘乙二胺反应体系测定血清中亚硝酸根的研究工作[6]，但使用的是萘胺类试剂。而利用氨基苯磺酸和8-羟基喹啉为测定体系，采用示波极谱用于检测蔬菜中亚硝酸盐已见报道[7]，但尚未见用于人血清NO2-含量测定的报道。

1 材料与方法

1.1仪器 JP-303型极谱分析仪(成都仪器厂)。

1.2实验对象 实验用正常人血清标本均为包头医学院第一附属医院检验科及内蒙古医院检验科2007年2月至5月体检正常成人血清(年龄30～50岁)。所有血清均-20℃冻存待测。

1.3试剂 NO2-标准溶液：用NaNO2配制成浓度为1.0 mg·ml-1的储备液，4℃保存，使用时稀释成浓度为1.0 μg·ml-1的应用液；0.1 mol·L-1HCl溶液；8.0 g·L-1对氨基苯磺酸溶液(对氨基苯磺酸2.0 g加水100 ml加热溶解再加入25 ml 1.0 mol·L-1HCl，定容至250 ml)；8-羟基喹啉1.0 g·L-1(8-羟基喹啉250 mg，加2.0 ml 1.0 mol·L-1HCl和3.0 ml乙醇溶解，定容至250 ml)；饱和EDTA·2Na溶液；5%氨水溶液。试剂均为分析纯，为北京化学试剂厂生产。所用水为去离子水。

1.4实验方法

1.4.1绘制标准工作曲线 在10 ml测量杯中加入0.3 ml的同一血清、NO2-标准溶液(浓度为1.0 μg·ml-1)0～0.5 ml、饱和EDTA溶液0.1 ml、对氨基苯磺酸1.5 ml、0.1 mol·L-1HCl 0.1 ml和8-羟基喹啉溶液1.0 ml，于25℃放置 20分钟，然后加入5%的氨水溶液1.0 ml，并用水将各反应管总体积补足为4.5 ml，25℃放置10分钟待测。在JP-303型极谱分析仪上，置三电极系统、阴极化、二阶导数档。待测溶液中插入三电极，从原点电位-0.3 V起作二阶导数扫描，于-0.68V处测量导数峰电流(nA)，极谱峰见图1， P0处为NO2-产生的特征峰，随着NO2-浓度的增高，在此处的峰电流不断增大，峰的电位值不变。以NO2-含量(μg·ml-1)为横坐标，以峰电流值(以下称峰值)为纵坐标，绘制标准工作曲线。

图1 亚硝酸根在血清本底下的二阶导数极谱峰

1.4.2血清样品测定 取0.3 ml血清样品于10 ml测量杯中，以下按制备工作曲线步骤操作。

2 结 果

2.1实验条件的选择

2.1.1汞柱高度与原点电位 在不同汞柱高度测定峰电流，结果表明，在可测范围内，峰电流(H)与汞柱高度(h)呈正比，即H=1.32×102h +9.82，r=0.999。峰电位无变化。改变扫描电位测定峰电流，结果表明扫描电位负移且峰电流下降。原点电位在-0.3 V时极谱峰电流最高且稳定，故本实验选择-0.3 V为扫描电位。

2.1.2血清中的蛋白质、酶类的影响 血清中的蛋白质、酶类会严重抑制峰电流，没有加入血清时的标准曲线斜率为132.6，加入血清0.3 ml后则降低至4.19，如图2所示，检测灵敏度大大降低，故测定血清中NO2-时必须用工作曲线法进行定量，通过以血清为测量的背景基底就可以把这些蛋白等物质的综合影响扣除。

图2 对氨基苯磺酸-8-羟基喹啉体系血清抑制曲线

2.1.3试剂用量 (1)饱和EDTA·2Na溶液的用量：适宜的用量范围为0.1 ml，随着用量进一步增加，峰电流将降低，如图3所示。(2)0.1 mol·L-1HCl用量：适宜的用量为0.1～0.5 ml之间，相应的pH值在1.8左右，有利于重氮偶合反应，峰电流最高。(3)乙醇的用量：随着乙醇量的增加会抑制峰电流，如图4所示。在溶解8-羟基喹啉时加3 ml乙醇即能完全溶解所需的8-羟基喹啉，故乙醇的用量选择为12 ml·L-1为宜。

图3 不同饱和EDTA用量下的峰值变化

图4 不同乙醇用量下的峰值变化

2.1.4缓冲体系的选择 选择硼砂-氢氧化钠缓冲体系，维持pH值在9.0，峰形有所改变，出现一杂峰，而且峰电流较低。采用氨-氯化铵缓冲系统，维持pH值在9.0，没有杂峰，且峰电流很高。选择5%氨水得到的峰电流最高，有利于偶氮反应，故本方法选择5%氨水1.0 ml，峰电流最高。

2.1.5重氮化温度与时间 理论上讲重氮化反应应在0～5℃，虽然低温是适宜的，但反应速度会降低，反而影响峰电流，试验结果表明4℃时测定峰值低于室温25℃时的峰值，通过不同温度下的标准曲线测定，25℃时标准曲线斜率为179.42，而4℃时则为117.69，测定的灵敏度下降。在室温条件下温度的波动对测定结果影响不大，故本实验选择25℃为反应温度。本实验方法在25℃反应时间20分钟即可完成，随着时间的延长，峰电流不再增加。

2.1.6测定液的稳定性 亚硝酸盐与对氨基苯磺酸和8-羟基喹啉进行反应而形成的偶氮化合物在本测定条件下至少稳定4小时。

2.1.7常见共存离子的影响 实验结果表明，在本实验方法中，高于正常血清中500倍的Zn2+、Cu2+、Ba2+，300倍的Al3+，200倍的Pb2+、Cd2+，110倍的Mg2+，20倍的Fe3+均不干扰测定，说明EDTA·2Na能够较好地掩蔽金属离子的干扰。

2.2标准工作曲线回归方程及血清中NO2-含量(μg·ml-1)计算式

标准工作曲线的回归方程：Hx=178.76 CNO2-，r=0.998，Hx为峰电流值，C为NO2-含量(μg·ml-1)。标准工作曲线如图5所示。

图5 对氨基苯磺酸-8-羟基喹啉体系标准工作曲线

2.3方法精密度 取3组血清样品，每组均为同一正常人，进行八次平行测定，计算结果精密度，结果的精密度见表1，由表1可知，应用此方法测定血清中NO2-含量的相对标准偏差范围为4.91%。

表1 方法精密度(n=8)

2.4方法准确度 在血清样品中加入不同量的NO2-标准，按分析方法进行测定，以加标回收率表示方法准确度，结果见表2。由表2可知，此方法的回收率范围为：96.5%～112.9%。平均加标回收率为102.6%。

表2 方法准确度(n=8)

2.5方法检出限和工作曲线线性范围 按实验方法配制20个试剂空白溶液并测量相应的峰电流，根据公式L=3Sb/S(L：为检出限；Sb：为试剂空白溶液峰电流的标准偏差；S：为回归直线方程的直线斜率)求得方法的检出限，相当于血清中的含量为9.6×10-3μg·ml-1。标准工作曲线线性范围：在血清样品中，加入不同浓度的NO2-标准溶液，检测极谱峰电流，绘制浓度-峰电流曲线图，得到其线性范围。相当于血清中的含量为0.05～66.7 μg·ml-1，在此范围内NO2-浓度与峰电流呈良好的线性关系，r=0.998。

2.6 方法应用 血清采自内蒙古医院的体检正常成人，共43例，取血清0.3 ml，操作同实验方法，测量样品溶液的峰电流，用标准曲线法定量。测得的亚硝酸根浓度在0.35～0.58 μg·ml-1之间，与孙成均结果相近。

3 讨 论

示波极谱法是一种操作简单，灵敏度较高，测量快速准确，检出限低和测量误差小的实验方法，可以广泛应用于测定生物样品中的微量重金属(如铅、镉)[8-9]、亚硝酸根离子的浓度，也可以用于测定药品的有效成分[10-12]等。示波极谱法[13-14]测定的NO2-原理是将样品在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合成染料，该偶合染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐浓度成线性关系，可用标准曲线定量。实验结果表明，我们选择对氨基苯磺酸和8-羟基喹啉为测定体系，使用二阶导数示波极谱法为分析手段，测定血清中的NO2-，得到较偶氮染料比色法安全的分析方法，避免了有毒试剂α-奈胺的使用。所用主要试剂安全且用量很少，该方法具有可不进行血清蛋白的去除而直接进行测定的特点，适合于大批量血清样本的测定。

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