结直肠癌中Ezrin的表达及与预后的关系

姚冬颖 许欣 赵振亚

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率及死亡率均有明显上升的趋势［1］。侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学行为和致死因素。埃兹蛋白(Ezrin蛋白)是新近发现且备受关注的肿瘤转移相关基因，研究发现其参与多种肿瘤的侵袭和转移过程。本研究通过免疫组化方法检测结直肠癌中的Ezrin蛋白的表达情况，探讨其在结直肠癌侵袭和转移中的作用，为临床诊断、治疗和预后判断提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2006年1月至2007年12月期间手术切除且临床病理及随访资料完整的结直肠癌标本120例，所有患者术前均未接受化疗、放疗和免疫治疗。男64例，女56例;年龄39～82岁，平均年龄59岁;肿物位于结肠54例，位于直肠66例;肿瘤最大直径＜5cm者44例，＞5cm者76例;高-中分化73例，低分化47例;侵犯深度未侵及浆膜35例，侵及浆膜85例;无淋巴结转移的78例，有淋巴结转移的42例;Dukes分期A+B期68例，C+D期52例。同时取正常结直肠黏膜组织20例作为对照。所有标本均采用常规取材，经10%中性缓冲甲醛液固定，石蜡包埋，做4 μm厚连续切片，做HE及免疫组化染色。

1.2 方法 应用免疫组vision两步法，鼠抗人Ezrin单克隆抗体(工作液)及免疫组化试剂盒均购于福州迈新生物技术有限公司。切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液中高温修复抗原15 min，室温下自然冷却，3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶活性10 min，滴加一抗，湿盒内4℃过夜，滴加聚合物增强剂，滴加酶标抗鼠/兔聚合物，DAB显色。以试剂公司提供的阳性切片作阳性对照，PBS(磷酸盐缓冲液)代替一抗作阴性对照，每例都有HE切片作为对照观察。免疫组化结果判定标准Ezrin蛋白阳性定位于细胞质或细胞膜，依据细胞显色的有无及深浅，按双评分化Eli半定量方法判断。随机计数5个不同高倍镜视野(400×)，每高倍视野计数200个瘤细胞，先依据显色深浅评分:0分，无显色;1分，浅黄色;2分，棕黄色;3分，棕褐色。再依据显色比例评分:1分，显色细胞＜25%;2分，显色细胞25% ～50%;3分，显色细胞 51% ～75%;4分，显色细胞＞75%。最后以两者乘积的得分值作为判定标准:0～4分为阴性表达，5分以上为阳性表达［2］。以上结果由两位病理科医生在双盲情况下观察确定。

1.3 随访 对120例患者进行随访获取生存或死亡信息，生存时间按月计算，以手术日至末次随访所得的时间为准。本组患者死亡82例，结尾38例，生存时间为22～79个月，中位生存时间为59个月。

1.4 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，不同组织类型中蛋白表达的关系、结直肠癌组织中Ezrin蛋白的表达与临床病理之间的关系比较采用χ2检验，生存率的比较用kaplan-Meier生存曲线，Log-rank检验，Cox多因素分析筛选影响患者预后的独立因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ezrin蛋白在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达 Ezrin蛋白在细胞质内呈棕黄色颗粒分布，细胞膜也有部分着色。在120例结直肠癌组织中有74例呈阳性表达，阳性表达率为61.7%，20例正常结直肠黏膜中仅4例呈阳性表达，阳性率为20.0%，2组间差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表1，图1、2。

2.2 结直肠癌组织中Ezrin蛋白的表达与临床病理指标的关系 Ezrin蛋白的表达与分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期密切相关(P ＜0.05)，与性别、年龄、肿瘤部位和大小无关(P ＞0.05)。见表2。

表1 Ezrin蛋白在不同大肠组织中的表达 例(%)

图1 Ezrin蛋白在正常结直肠组织中的表达(IHC×200)

图2 Ezrin蛋白在结直肠癌组织中的表达(IHC×200)

表2 Ezrin蛋白的表达与大肠癌临床病理参数的关系 例(%)

2.3 结直肠癌组织中Ezrin蛋白的表达与生存期的关系 Ezrin蛋白阳性表达患者5年生存率为35.1%，中位生存时间为42个月，Ezrin蛋白阴性表达患者5年生存率为73.9%，中位生存时间为69个月。绘制kaplan-Meier生存曲线，生存率的比较经Log-rank检验，Ezrin蛋白的阳性表达组生存期显著低于阴性组(χ2=28.106，P=0.000)。见图3。

图3 结直肠癌组织中Ezrin阳性表达组和阴性表达组累积生存曲线

2.4 影响生存期的Cox多因素分析 经Log-rank检验筛选出对结直肠癌生存有影响的因素为分化程度(χ2=19.173，P=0.000)、浸润深度(χ2=16.120，P=0.000)、淋巴结转移(χ2=111.646，P=0.000)、Dukes分期(χ2=122.834，P=0.000)和 Ezrin 的表达情况(χ2=28.106，P=0.000)。再进行 Cox比例风险回归模型多因素分析，结果显示淋巴结转移(P=0.019)、Dukes分期(P=0.000)及 Ezrin 的表达(P=0.010)为影响结直肠癌预后的独立危险因素。见表3。

表3 预后相关因素的Cox回归多因素分析

3 讨论

恶性肿瘤的浸润和转移是威胁生命的主要原因。肿瘤的侵袭和转移是一个包含复杂步骤的过程，癌细胞需经历从原发灶脱落、细胞粘附于基质、蛋白水解酶降解基质等向周围组织侵袭或进入淋巴系统而进一步向远处转移Ezrin是ERM家族成员，编码的基因是Villin2，人类定位于染色体6q25.2～q26，mRNA全长3166 bp，编码585个氨基酸。该家族包括Ezrin、Redixin、Moesin、Merlin四种结够相近的蛋白，在调节细胞形状、生长、运动、粘附力、信号传导等活动中发挥作用。主要由三个结构域组成:氨基末端、螺旋区、羟基末端。Ezrin通过参与细胞内信号传导、调整细胞间粘附分子及细胞骨架连接等途径，影响肿瘤侵袭转移等生物学行为［3，4］。已有报道，Ezrin 蛋白在食管癌［5］、乳腺癌［6］、骨肉瘤［7］等多种恶性肿瘤中高表达，是预后不良的分子标志物。

我们的研究结果显示，Ezrin蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达显著高于正常组织，提示Ezrin蛋白的表达可能对结直肠癌的发生、发展发挥了促进作用。本研究还显示，Ezrin蛋白的表达与结直肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期密切相关，且其表达水平随肿瘤分化的降低、浸润深度的增加、淋巴结转移的发生及临床分期的进展逐渐升高，提示Ezrin蛋白表达上调可能参与了结直肠癌的恶性演变过程，Ezrin蛋白高表达的结直肠癌有较高的侵袭性和转移倾向。这一结果与李宏伟等［8］的研究结果一致。手术后对患者进行长期随访进行生存分析，发现Ezrin蛋白的阳性表达组生存期显著低于阴性组。Cox多因素分析显示淋巴结转移、Dukes分期及Ezrin的表达为影响结直肠癌预后的独立因素。由此可见，检测Ezrin蛋白的表达情况可作为判断结直肠癌侵袭程度和评估患者生存期的可靠指标。

综上所述，Ezrin蛋白的异常表达贯穿于结直肠癌的早期发生到晚期转移的全过程，Ezrin蛋白可能成为评估患者预后和生存时间的指标之一，并为基因治疗提供新的靶点。

1 宋晓昕.Fascin、β-catenin、E-cadherin在大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义.河北医药，2010，32:2178-2180.

2 刘晔，杨静，李辉，等.Ezrin和CD44V6在胃癌中的表达及其临床意义.临床与实验病理学杂志，2009，25:143-146.

3 Jin JC，Jin TF，Quan ML，et al.Ezrin overexpression predicts the poor prognosis of gastric adenocarcinoma.Diagn Pathol，2012，7:135.

4 Ho Won Lee，Eui Han Kim，Mee-Hye Oh.Clinicopathologic Implication of Ezrin Expression in Non-small Cell Lung.Cancer Korean J Pathol，2012，46:470-477.

5 Xie JJ，Xu LY，Wu ZY，et al.Prognostic implication of ezrin expression in esophageal squamous cell carcinoma.J Surg Oncol，2011，104:538-543.

6 Zheng S，Huang J，Zhou K，et al.17β-Estradiol enhances breast cancer cell motility and invasion via extra-nuclear activation of actin-binding protein Ezrin.P Los One，2011，6:e22439.

7 Kim C，Shin E，Hong S，et al.Clinical value of ezrin expression in primary osteosarcoma.Cancer Res Treat，2009，41:138-144.

8 李宏伟，许若飞，王铁山，等.结直肠癌组织中Ezrin蛋白的表达及其临床意义.中国现代普通外科进展，2012，15:102-104.