一株抗肿瘤活性的红树林细菌的筛选及鉴定

刘 悦，张京京，黄宇明，李 荷

（1.广东药学院基础学院，广东广州 510006；2.深圳市罗湖外语学校，广东深圳 518004）

一株抗肿瘤活性的红树林细菌的筛选及鉴定

刘 悦1，张京京2，黄宇明1，李 荷1

（1.广东药学院基础学院，广东广州 510006；2.深圳市罗湖外语学校，广东深圳 518004）

从深圳红树林土壤中分离出一株嗜盐细菌S17，对其进行生理生化特性研究并进行潜在的抗菌和抗肿瘤活性评价，采用16S rDNA序列分析及系统发育分析方法对其进行分子鉴定。研究结果表明：菌株S17为中度嗜盐细菌，与短小芽孢杆菌属Bacillus pumilus ATCC 7061具有99%同源性。S17的粗提物对多种细菌和肿瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用，可以进行进一步的开发和利用。

红树林；中度嗜盐细菌；抗菌活性；抗肿瘤活性

0 引言

随着微生物来源的药物需求量不断增加，向海洋微生物寻求药用物质和药物先导化合物已成为各国的研究重点［1－4］。红树林是热带、亚热带陆地与海洋潮间带的木本植物群落，是一种比较特殊的森林生态系统，也是物种多样性最丰富的生态系统之一，具有重要的生态地位。红树林区的微生物由于所处耐盐、厌氧等特殊生境，遗传及生理特性与其他生境中的微生物相比具有特异性，具有产生新型活性物质的潜力，是开发新药的重要资源［5－8］。目前，已经从红树林土壤中筛选出多种有用物质［9－11］。本研究主要是对从深圳福田红树林自然保护区土壤中分离纯化到的Bacillus pumilus属细菌S17进行分离鉴定，研究其代谢产物的抗菌和抗肿瘤活性，以期作为新的生物活性物质的来源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验样品采集于深圳福田红树林自然保护区中红树林根泥，4℃保存，进行后续的菌株筛选。

分离培养基（1 L）：胰蛋白胨5 g、牛肉膏2 g、酵母粉1.5 g、葡萄糖5 g、K2HPO40.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 5 g、（NH4）2SO40.1 g、琼脂15 g、pH7.0。

1.2 菌株的分离纯化及生化鉴定

将采集土样用无菌水进行适当稀释成10－1～10－5梯度浓度，取100μL稀释液涂布于分离培养基上，37℃倒置培养2～3 d，挑取单菌落平板划线分离、纯化菌种。观察菌株的生长形态，根据《常见细菌系统鉴定手册》［12］和《伯杰氏细菌鉴定手册》［13］进行常规生化鉴定。

1.3 菌株的耐盐度特性测定

将筛选的菌株接种于不同盐浓度的液体培养基中，NaCl终浓度（g／100 mL）分别为0%、1%、3%、5%、7%、9%、11%、15%，37℃，170 r／min恒温培养，培养2～3 d，测OD600，测定菌种生长浓度。

1.4 菌株的16S rDNA的序列测定及系统发育分析

用SDS法提取细菌DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1 492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR反应扩增16S rDNA基因。PCR产物用omega胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的菌种16S rDNA与pMD 18-T载体（Takara）进行连接，将连接片段转入经CaCl2处理的Escherichia coli DH5α感受态细胞中，采用选择性LB培养基平板（加氨苄青霉素、IPTG、X-gal）进行阳性克隆子的筛选。提取白色阳性克隆单菌落的质粒，经酶切验证后送测序，测序由华大基因完成。

测序结果与GenBank中已有的序列进行BLAST对比。选择相似性最大的即同源性比较高的菌株16S rDNA序列进行序列比对，构建系统进化树。采用Clustal X1.83软件进行多序列比对，利用MEGA4.0绘制系统进化树。菌株S17的16S rDNA序列已经提交到NCBI的GenBank数据库中，序列号为KC778622。

1.5 抗菌及抗肿瘤活性的测定

利用平板划线法得到细菌S17的单菌落，挑选一个单菌落接种到含有20 m L改良培养基中，37℃、175 r／min，培养12 h，将20 mL种子液接种到200 mL相同培养基中；同样生长条件培养48 h，菌种发酵液离心（5 000 r／min，25℃，10 min），上清液用乙酸乙酯抽提3次，收集有机相，旋转蒸发仪60℃减压浓缩至适量，冷冻干燥，得发酵粗提取样品；精密称取适量该提取样品，用体积分数为80%的甲醇溶液溶解粗提取样品至终浓度为10 mg／m L的样品溶液，用于抗菌和抗肿瘤活性检测，以80%的甲醇作空白对照溶液。

采用牛津杯法进行抗菌活性的测定，以金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和黑曲霉（Aspergillus niger）作为指示菌。根据抑菌圈的直径定性判断菌株的抗菌能力。

采用MTT法检测嗜盐细菌S17粗提物对人肝癌细胞HepG2细胞增殖的抑制作用。取对数生长期的HepG2细胞，用新鲜DMEM高糖培养基配制成2×105个／m L的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔加细胞悬液200μL，37℃培养1 h后，每孔加样品液或空白对照溶液各2μL，每个浓度设3个复孔，继续37℃培养24 h。培养结束后，每孔加5 mg／m L的MTT溶液20μL，37℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μL，室温充分振荡10 min使MTT紫色产物完全溶解，测量570 nm处的吸光度（OD）。取OD平均值，以空白对照组为100%，按下式计算抑制率（IR%）：

2 结果与分析

2.1 菌株S17的形态特征

菌株S17在分离培养基中生长状况良好，如图1所示，菌落表面色暗有褶皱，淡黄色，不规则形，不透明，革兰氏染色显示S17为革兰氏阳性，菌体形态呈杆状，很少成链。染色均匀，菌体大小为（0.6～0.7）μm×（2.0～3.0）μm。

2.2 菌株S17的生理特征

耐盐度特性试验结果见表1，由表1可看出：菌株S17在盐浓度为0%～15%培养基中可以生长，生长最适盐质量浓度范围为5%～11%，最适盐质量浓度为5%，在低盐质量浓度（＜5%）和高盐质量浓度（＞11%）培养基中生长相对缓慢，根据文献中嗜盐菌的分类，将其归属于中度嗜盐菌［14］。

图1 Bacillus sp.S17的菌落形态

表1 盐度对菌株S17生长的影响

2.3 菌株S17的系统发育分析

菌株S17的16S rDNA基因序列分析结果见图2，它与短小芽孢杆菌Bacillus pumilus ATCC 7061（NR_043242）聚类为一支，它们的16S rDNA序列相似性高达99%，判断S17与Bacillus pumilus最接近，可以初步确定菌株S17属于芽杆菌属。

图2 中度耐盐菌S17及其相关属种的16S rDNA序列构建的系统发育树

2.4 抗菌活性筛选结果

表2为细菌S17的抗菌性筛选结果，由表2可知：菌株S17的粗提物对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌和丝状真菌黑曲霉均有明显抗菌活性，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌无抗菌活性。可见，菌株S17的粗提物的抗菌活性以抗革兰氏阳性菌为主，对指示菌的抑制强度表现为革兰氏阳性菌＞革兰氏阴性菌＞丝状真菌，其中S17抑制金黄色葡萄球菌的能力最强，抑菌圈为10.1 mm。

用MTT法检测细菌S17发酵粗提物的细胞毒活性，测得3个复孔OD570值分别为：OD1＝1.271，OD2＝1.258，OD3＝1.352，RSD＝0.051，因此，OD样品＝1.294±0.051，OD空白＝2.703±0.024，其IR为52.2%。结果表明：其粗提物对人肝癌细胞的增殖具有明显抑制作用，而阴性空白对照对人肝癌细胞HepG2未显示细胞毒性作用。

表2 细菌S17的抗菌活性筛选结果

3 讨论

本研究筛选分离出的嗜盐菌S17最适盐质量浓度范围为5%～11%，，根据嗜盐菌的分类，中度嗜盐菌最适生长盐质量浓度3%～15%（0.5～2.5 mol／L），因此属于中度嗜盐菌。已有的研究结果表明，中度嗜盐菌有着重要的研究价值和广阔的应用前景，对其研究主要是集中在对其产生的酶、一些功能性分子和大分子多聚物以及生物环保等方面。普通酶在高盐条件下会变性失活，而嗜盐菌产生的酶在高盐条件下仍能保持较高的活性和稳定性，更能适应工业生产条件的需要，因而具有极高的应用潜能。文献［15］从烟台海域也分离筛选出一株中度嗜盐芽孢杆菌YTM-5，最适宜的生长条件为3%盐质量浓度，本研究筛选出的S17最适生长条件为5%盐质量浓度，相比较而言，S17更加耐盐，从而也更能满足工业应用的需要。

通过对菌株S17生理特性的研究和16S rDNA序列的比对，确定其为Bacillus pum ilus属的中度嗜盐菌，进一步研究了其对多种指示菌的抗菌活性及对肿瘤细胞的抑制作用，将其应用于药用活性物质的筛选。研究结果显示：菌株S17对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以黑曲霉为代表的丝状真菌表现出很强的抑制作用，并对人肝癌细胞HepG2有很强的抑制作用，可以作为发现新型生物活性物质的潜在资源。近几年研究人员已经从多种生境中分离到一批具有抗菌、抗肿瘤的细菌和真菌。比如，文献［16］从北极的沉积物中筛选出一株嗜冷细菌，以人胃癌细胞MGC80-3为测试细胞株，发现该菌株的发酵液有较强的细胞毒活性。文献［17］对100株深海真菌进行了抗肿瘤及抗菌活性检测，发现深海真菌具有良好的生物活性，细胞毒性阳性率占49%，26%的菌株具有明显抗大肠杆菌效果，23%抗枯草芽孢杆菌，5%抗白假丝酵母，21%抗金黄色葡萄球菌。这一系列的研究都表明，从微生物资源中探寻新型抗生素和抗肿瘤药物是一种行之有效的途径，本研究也为后期开发新药提供了研究基础。

［1］ Nikapitiya C.Bioactive Secondary Metabolites from Marine M icrobes for Drug Discovery［J］.Adv Food Nutr Res，2012，65：363－387.

［2］ Zotchev SB.Marine Actinomycetes as an Emerging Resource for the Drug Development Pipelines［J］.JBiotechnol，2012，158（4）：168－175.

［3］ Jaiganesh R，Sampath K，Sampath N.Marine Bacterial Sources of Bioactive Compounds［J］.Adv Food Nutr Res，2012，65：389－408.

［4］ Lordan S，Ross R P，Stanton C.Marine Bioactives as Functional Food Ingredients：Potential to Reduce the Incidence of Chronic Diseases［J］.Mar Drugs，2011，9（6）：1056－100.

［5］ Russo P，Cesario A.New Anticancer Drugs from Marine Cyanobacteria［J］.Curr Drug Targets，2012，13（8）：1048－1053.

［6］ Javed F，Qadir M I，Janbaz K H，et al.Novel Drugs from Marine M icroorganisms［J］.Crit Rev M icrobiol，2011，37（3）：245－249.

［7］ 朱兰，何伟，许书宁.抗肿瘤的海洋微生物筛选［J］.大连民族学院学报，2011（5）：524－525.

［8］ 曹雪，杨瑞丽.源于海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究［J］.药物生物技术，2007，14（4）：302－305.

［9］ Jiang Y X，Zheng T L，Tian Y.红树林土壤微生物的研究：过去、现在、未来［J］.微生物学报，2006，46（5）：848－851.

［10］ Xu J.Biomolecules Produced by Mangrove-associated Microbes［J］.Curr Med Chem，2011，18（34）：5224－5266.

［11］ 程中山，徐树兰，陈其津.代谢产物具杀虫活性的红树林真菌1893菌株培养条件的研究［J］.环境昆虫学报，2008，30（2）：120－126.

［12］ 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：北京科学出版社，2001：242－244，259－266.

［13］ Holt JG，Krieg N R，Sneath PH A，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology［J］.9 ed.Baltimore：W illiams＆W ilkins，1994：175－187.

［14］ 冯二梅，宿红艳，王磊.中度嗜盐菌的研究进展［J］.安徽农业科学，2009（31）：15125－15126，15190.

［15］ 王磊，冯二梅，宿红艳.烟台海域一株中度嗜盐芽孢杆菌YTM-5的鉴定及其耐盐机制研究［J］.新乡学院学报：自然科学版，2010（3）：50－55.

［16］ 曾润颖，李根，林昱.一株具抗肿瘤活性的北极细菌的筛选及分子鉴定［J］.厦门大学学报：自然科学版，2002（6）：800－803.

［17］ 徐新霞，易志伟，马群，等.100株深海真菌次生代谢产物的生物活性初步研究［J］.台湾海峡，2010（4）：465－472.

Q7

A

1672－6871（2014）01－0071－04

国家自然科学基金项目（30970107）；广东省科技厅基金项目（2012B01030002）

刘 悦（1987－），女，安徽阜阳人，硕士生；李 荷（1968－），女，黑龙江绥化人，为通信作者，教授，博士，硕士生导师，主要从事微生物分子生物学的研究.

2013－04－12