麻栎树皮多酚含量的测定及抗氧化活性的研究

杨春涛，曾晓丽，戴建辉，孙静贤，李世源，李新明，黄相中，田 凯

（1.云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明650500；2.云南民族大学云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南昆明650500）

麻栎树皮多酚含量的测定及抗氧化活性的研究

杨春涛1，2，曾晓丽1，2，戴建辉1，2，孙静贤1，2，李世源1，2，李新明1，2，黄相中1，2，田 凯1，2

（1.云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明650500；2.云南民族大学云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南昆明650500）

采用分光光度法、DPPH法和连苯三酚红（PR）法对麻栎树皮提取物进行多酚化合物含量及抗氧化活性测定，讨论了用不同溶剂提取对多酚含量的影响.结果表明采用70%乙醇进行提取，提取物中多酚含量最高，为（6 589.91±43.32）mg／100 g.抗氧化活性测试中，麻栎树皮的不同溶剂提取物对DPPH自由基和羟自由基都表现出较高的清除率，其中麻栎树皮70%丙酮提取物的活性最好，在0.18mg／mL质量浓度下，对DPPH自由基清除率为70%，在0.38mg／mL质量浓度下，对羟自由基氧化率为75%.

麻栎；多酚类；抗氧化活性

麻栎（Quercus acutissima Carruth）又名橡树、栎木，系壳斗科栎属（Quercus）落叶乔木，在我国分布广泛，栽培历史悠久，是传统的优良能源树种［1-3］.麻栎在我国常被作为中药材使用，其果实、树叶、树皮具有解热、收敛、止血等功效［4-5］.多酚类化合物是植物体内的复杂酚类次生代谢产物，主要存在于植物体的皮、根、叶、壳和果肉中［6-7］.多酚类化合物具有多种生物活性，如降低血液尿素，抗过敏，抑制angiotension converting酶，抗胃蛋白酶，抗病毒等作用［8-11］.罗侠等［12］曾对麻栎树叶中黄酮类化合物进行研究，并对其抗氧化活性进行了评估，但尚未见文献对麻栎树皮化学成分和药理活性的研究，本文采用回流提取法研究麻栎树皮多酚类化合物的含量，研究了4种不同溶剂对提取物多酚含量的影响，并采用DPPH法和连苯三酚红（PR）法对麻栎树皮提取物的抗氧化活性进行了评估.

1 主要材料与仪器

麻栎样品于2010年9月采自云南腾冲，经云南民族大学杨青松副教授鉴定为Quercus acutissima Carruth，标本存于云南民族大学化学与生物技术学院标本室.麻栎树皮样品粉碎备用；没食子酸（北京市通广精细化工公司生产）；二苯代苦味基自由基（DPPH）（日本东京化成株式会社生产）；连苯三酚（北京利德曼公司生产）；丙酮、三氯化铁、铁氰化钾，盐酸，无水乙醇，三氯化铁，铁氰化钾均为分析纯.WFJ-7200型分光光度计，旋转蒸发仪等.

2 实验方法

2.1 麻栎树皮中多酚类化合物的提取

取麻栎树皮粉碎物40 g 4份，分别用体积分数为95%乙醇、70%乙醇、丙酮、70%丙酮回流提取2.5 h，趁热过滤.重复提取3次，合并滤液；减压蒸馏回收溶剂得提取物，放于室内使其自然挥干，提取物质量分别为：5.69、8.35、6.39、6.78 g.取各提取物以无水乙醇溶解配置成1.05、1.25mg／mL的溶液备用.

2.2 多酚含量的测定

2.2.1 标准曲线的建立

精密称取没食子酸对照品25mg于50mL容量瓶中，60%的乙醇溶解并加之刻度，得到0.5mg／mL的标准品溶液.精密吸取该溶液2.5mL于25mL的容量瓶中，加入60%的乙醇至刻度，配成50μg／mL的标准品溶液.参照文献［13］，精密吸取没食子酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25 mL比色管中，依次加入0.5mL的0.100mol／L三氯化铁，0.50 mL的0.008 mol／L铁氰化钾0.50 mL和0.10 mol／L盐酸，用60%乙醇定容，得到不同浓度的对照品溶液.置于暗处15min后，以蒸馏水为参比液，用WFJ-7200型分光光度计695 nm处测定吸光度，以没食子酸质量浓度（μg／mL）为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制标准曲线.

2.2.2 样品的测定

取适宜体积已配置的麻栎树皮提取液，按标准曲线制备操作步骤于695 nm波长下分别进行吸光度的测定，根据标准曲线计算出每种提取方法的多酚类化合物含量及提取率.

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH法［14］分析样品对自由基的清除能力

往10mL比色管中依次加入4mL pH为6.88标准磷酸盐缓冲溶液，4mL 0.177 7mmol／LDPPH溶液，混匀，再加入一定量抗氧化剂溶液，用蒸馏水补至刻线，充分混匀，10min后在520 nm处测量吸光度.定义抗氧化剂对DPPH自由基的清除率K：

式中：A1为加抗氧化剂反应后DPPH溶液吸光度；A2为不加DPPH，只加抗氧化剂及水的溶液的吸光度；Ac为未加抗氧化剂，只加DPPH及水的溶液的吸光度.按实验方法加入不同体积的抗氧化剂（质量浓度均为1.25mg／mL），测出A1，A2，Ac，据此计算出其相应的自由基清除率K.

2.3.2 连苯三酚红褪色光度［14］

往10mL具塞比色管中，依次加入2mL pH为9.1的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，0.7mL 0.003 8mol／L EDTA-Fe2＋溶液，3.5mL 0.000 1mol／L连苯三酚红溶液，0.7mL体积分数为0.6%H2O2溶液，蒸馏水补充至刻线后在25℃保温反应30min（均需摇匀），测544 nm处的吸光度.设不加H2O2时的吸光度为A0，加入H2O2后的吸光度为Ab，则羟自由基产生量可用ΔA＝A0-Ab来表示.在体系中加H2O2之前加入一定量的抗氧化剂，测定其吸光度A s，则抗羟自由基氧化率为S：

按实验方法加入不同体积的抗氧化剂（质量浓度均为1.05mg／mL），测出As，Ab，A0，计算出（As-Ab）／（A0-Ab）值，据此再计算出其相应的抗羟自由基氧化率S.

3 结果与分析

3.1 多酚化合物含量测定结果

3.1.1 用没食子酸为参比标准衡量样品提取液中的多酚类化合物含量

以没食子酸质量浓度ρ（μg／mL）为横坐标，695 nm处吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得的回归方程为y＝0.408 2 x-0.009，R2＝0.999 3，绘制的标准曲线见图1.

3.1.2 测定方法的稳定性、精密度、重现性以及加标回收率

实验结果如表1所示，从表中可见该方法实验结果可靠，符合实验要求.

3.1.3 样品测定

分别吸取1.0mg／mL已配置的样品溶液0.5mL于25mL量瓶中，依次加入0.100 mol／L三氯化铁溶液0.5 mL、0.008 mol／L铁氰化钾溶液0.5 mL和0.10 mol／L盐酸溶液0.5 mL，定容.按3.1.1项下的方法制备空白溶液.随后空白溶液在695 nm波长处测定吸光度，并根据标准曲线计算样品中多酚类化合物的含量，测定结果见表2.由表可知：麻栎树皮提取物中多酚类化合物含量均比较高，其中70%乙醇提取物的多酚含量最高，为（658 9.91± 43.32）mg／100 g.

表1 测定方法的稳定性、精密度、重现性及加标回收率的相对标准偏差（n＝5） %

表2 多酚含量测定结果 mg／100 g

3.2 抗氧化活性的测定

3.2.1 DPPH法分析样品对自由基的清除能力

按实验方法加入不同体积的抗氧化剂（质量浓度均为1.25mg／mL）测出A1，A2，Ac，据此计算出其相应的自由基清除率K，结果见图2.从图中可以看出：麻栎树皮提取物对DPPH自由基的清除率与其浓度呈正相关系，当达到一定浓度时，DPPH自由基清除率达到饱和，不再随浓度的增加而增加；浓度为0.18mg／mL时，70%丙酮提取物对DPPH自由基的清除率达最大值，为70%.

3.2.2 连苯三酚红褪色光度法

按实验方法加入不同体积的抗氧化剂（质量浓度均为1.05mg／mL）测出As，Ab，A0，据此计算出其相应的抗羟自由基氧化率S，结果见图3.由图可知：麻栎树皮提取物的抗羟自由基氧化率随提取物质量浓度的增大而增大，当达到一定浓度时，其抗羟自由基氧化率达到饱和，不再随质量浓度的增大而增大；质量浓度为0.38mg／mL时，70%丙酮提取物的抗羟自由基氧化率达最大值，为75%.

4 结语

用4种溶剂对麻栎树皮进行回流提取，发现4种提取物的多酚含量都比较高，表明麻栎树皮中多酚类化合物的含量较大.其中70%乙醇提取物的多酚含量最高，达到（6 589.91±43.32）mg／100g.表明70%乙醇溶液为提取麻栎树皮多酚的理想溶剂.采用2种方法对麻栎树皮提取物的抗氧化活性进行评估，得出麻栎树皮提取物对DPPH自由基和羟自由基均有较高的清除率，其中麻栎树皮70%丙酮提取物的活性最好，其在0.18mg／mL质量浓度下，对DPPH自由基清除率达最大值，为70%.在0.38mg／mL质量浓度下，对羟自由基氧化率达最大值，为75%.为进一步对麻栎的开发和利用提供了可靠的实验数据和理论依据.

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（责任编辑 王 琳）

Polyphenol content and antioxidant activity of the barkof Quercus acutissima Carruth

YANG Chun-tao1，2，ZENG Xiao-li1，2，DAI Jian-hui1，2，SUN Jing-xian1，2，LI Shi-yuan1，2，LI Xin-ming1，2，HUANG Xiang-zhong1，2，TIAN Kai1，2
（1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China；2.Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan，Yunnan Minzu University，Kunming 650500，China）

Polyphenol content of the extracts from the bark of Quercus acutissima Carruth was determined by spectrophotometric method.The antioxidant activity of the extracts was evaluated by the DPPH free radical scavenging assay and pyrogallol autoxidation assay，respectively.Furthermore，the polyphenol contents of different extracts from this plant were investigated.The results show that the polyphenol content of 70%ethanol extract was the highest，which was（6 589.91±43.32）mg／100 g.All of the different extracts from Q.acutissima have good activities against DPPH free radical and hydroxyl free radical，the results show that the 70%acetone extracts have exhibited better antioxidant activity against DPPH free radical at the concentration of 0.18mg／mL with the inhibition rate of70%，and 75%against hydroxyl free radical at0.38mg／mL.

Quercus acutissima Carruth；polyphenol；antioxidant activity

R931.6

A

1672-8513（2014）06-0404-04

2014-04-16.

国家自然科学基金（21262047）；云南省应用基础研究项目（S2012FZ0227）；云南民族大学传统傣药研究创新团队项目；SRT创新性实验项目（2013HXSSRTY06）.

杨春涛（1988-），男，硕士研究生.主要研究方向：天然药物化学.

田 凯（1971-），男，教授，硕士生导师.主要研究方向：天然产物化学与计算化学.