复方中药对免疫抑制小鼠免疫促进作用的研究

屈新辉 刘春发 胡建新 何 丹 项正兵 吴晓牧

1.江西省人民医院神经内科，江西南昌 330006；2.江西省神经病学研究所，江西南昌 330006；3.南昌大学医学院，江西南昌 330006；4.江西省人民医院药剂科，江西南昌 330006

免疫学是现代医学发展极为迅速的学科之一，疾病发生发展很多都与免疫功能有关，某些肿瘤患者在放疗、化疗后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但临床增强免疫力有明显临床疗效的药物却不多见。祖国医学认为“正虚邪扰”，疾病与人体的抵抗力密切相关，并且临床处方运用扶正祛邪的法则治疗疾病，临床观察亦有疗效，许多学者研究了多种单味药对免疫功能的调节作用，尝试发现、提取、合成能调节免疫的化合物，本实验旨在从细胞及分子水平出发，探求中药复方对免疫功能增强的作用及效能，在扶正固本、活血益气的中药中遴选出有广阔应用前景的促进免疫的中药复方。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药的制备

复方中药（由西洋参、黄芪、枸杞、当归等多味药）组成，按总量400 g（西洋参96 g、黄芪96 g、枸杞128 g、当归80 g）称取处方各药（由江西省人民医院药剂科供应），加蒸馏水400 mL，浸泡24 h，隔水煮1 h，滤过药液，药渣再加蒸馏水适量，煮1 h，滤出药液，合并两次药液，隔水浓缩至400 mL，即每1 mL相当于1 g生药的原液，灭菌封存备用。

1.1.2 实验动物

6 周龄昆明小鼠 50 只，体重（20±2）g，雌雄各半，均购自江西中医学院。动物自由饮食、饮水，动物质量合格证号：JIDW NO.2012-0041。试验过程中对动物的处置符合2006年科技部关于对试验动物的有关规定[1]。

1.1.3 试剂与仪器

免疫抑制剂环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：12030625），为 200 mg/支的粉针剂；小鼠IgG和补体C3的ELISA检测试剂盒为西唐生物公司进口分装产品（批号分别为：1208061、1208201）；Anti-MouseCD3（PE-Cy5）、Anti-MouseCD4（FITC）、Anti-Mouse CD8 （PE）、Anti-Mouse CD19 （PE）、Anti-MouseCD49（FITC）、Anti-MouseIL-2（PE）、Anti-MouseIFN-γ（FITC）荧光抗体 （购于eBioscience Inc.San Diego，CA公司，批 号 分 别 为 E06065-1630、E00077-1630、E01036-1633、E01047-1630、E00752-1630、E02060-1630、E00862-1631）；BECKMAN COULTER流式细胞仪；酶标仪（550 型）；倒置显微镜（Leica）；光学显微镜（OLYMPUS）；红细胞裂解液（实验室制自备）；PBS缓冲液（实验室制自备）；16号小鼠灌胃针；Allegra 64R低速冷冻离心机 （BECKMAN COULTER，rmax=204 mm）；HC电子天平（0.1 g）、sarrorious 电子天平（0.001 g），300目金属筛网。

1.2 方法

1.2.1 药物急性毒理试验

该复方中药各组份临床应用广泛，未见明显毒副作用，因此用小鼠灌胃最大容量0.4 mL/10 g[2]来检查药物的LD50，取20只小鼠，每次灌胃复方中药0.8 mL，2次/d，观察 15 d，无一死亡，可见 LD50＞ 0.4 mL/10 g。

1.2.2 实验分组

应用随机数字表法进行随机将动物分为5组：正常对照组、模型对照组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组。每组10只，雌雄各半。将需随机分组的雌雄性小鼠分别称重，按序编号记录体重结果，给每只小鼠鼠分配一个随机数，按随机数字大小升序排序，按排序后的顺序依次将小鼠分入各个剂量组 。各组体重均值再做F检验（单因素方差分析），需满足P＞0．05，如果条件不能满足，则重复以上过程，直到满足为止。随机分组结束后，分别按各组的原始编号编上实验编号。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型

建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg，造模完成[3]，正常对照组注射环磷酰胺溶剂生理盐水4 mL/kg。

1.2.4 给药方法

中药治疗组于环磷酰胺造模后第2天开始用中药按小鼠体重灌胃，高剂量中药组灌中药0.04 mL/g，中剂量中药组灌中药0.02 mL/g+蒸馏水0.02 mL/g，低剂量中药组灌中药0.01 mL/g+蒸馏水0.03 mL/g，正常对照组、模型对照组均灌蒸馏水0.04 mL/g，喂服14 d。

1.2.5 实验指标的检测

1.2.5.1 体重和脾脏指数 各组小鼠称量体重，于试验结束后断颈处死，取脾脏，用电子天平称湿重，计算脾指数，脾脏指数=100%脾脏质量/体质量（g/g）。

1.2.5.2 IgG和补体C3的检测 于试验第14天摘取眼球取血，室温放置2 h后3000 r/min离心10 min将血清和红细胞迅速小心地分离，离心得血清后严格按照ELISA试剂盒说明书方法检测小鼠血清IgG和补体C3水平。

1.2.5.3 脾淋巴细胞 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK细胞、细胞因子IL-2、IFN-γ检测 第14天取小鼠脾脏研磨成单细胞悬液经筛网过滤于离心管中离心，弃上清再加入红细胞裂解液离心，弃上清后加入PBS定容至1 mL，用倒置相差显微镜进行细胞计数，调节细胞数为 1×107～10×107个， 加入标记抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK 细胞、 细胞因子 IL-2、IFN-γ荧光抗体抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测淋巴细胞和细胞因子指标的变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计分析软件分析，所有计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。将资料进行正态性分析和Levene法方差齐性检验，行两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐采用Tamhane法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重和脾指数结果比较

正常对照组和模型对照组与各治疗组第1天的体重均值比较，差异无统计学意义（P=0.216＞0.05），表明随机分组成功。第14天的体重模型对照组比正常对照组减轻，差异有统计学意义（P=0.020＜0.05），而模型对照组与各治疗组体重比较，差异无统计学意义（P=0.126、0.904、0.796，均 P ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起体重减轻，而各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠体重无影响。脾指数模型对照组比正常对照组降低（P=0.0001＜0.05），而模型对照组与各治疗组比较，差异无统计学意义（P=0.967、0.255、0.941 ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起脾指数降低，而各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠脾指数无影响。见表1。

表1 各组体重和脾指数比较（x±s）

2.2 各组抗体IgG、补体及CD19结果比较

模型对照组比正常对照组IgG显著增高（P=0.002＜0.01），C3显著降低（正态分布方差不齐t检验，P=0.011＜0.05），而低剂量中药组与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P=0.001＜0.01），表明低剂量中药组能显著降低免疫抑制小鼠抗体IgG的浓度，升高免疫抑制小鼠补体C3浓度。见表2。

表2 抗体、补体及B淋巴细胞表面抗原CD19结果比较（x±s）

2.3 各组脾淋巴细胞 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋结果比较

CD3+、CD4+、CD8+模型对照组均值均低于正常对照组 （P ＜ 0.05），CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+模型对照组水平与低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示复方中药对特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫无促进作用。见表3。

表3 T淋巴细胞表面抗原结果比较（x±s）

2.4 各组脾淋巴细胞CD49b+结果比较

CD49b+、IL-2、IFN-γ 模型对照组水平均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组均值均增高，但仅低剂量中药组CD49b+与模型对照组比较，差异有高度统计学意义（P=0.008＜0.01），表明小剂量复方中药对免疫抑制小鼠非特异性免疫NK细胞有免疫促进作用。IL-2、IFN-γ低剂量中药组、中剂量中药组与模型对照组比较，差异有统计学意义（IL-2：P=0.004、P=0.039；IFN-γ：P=0.026、P=0.024，P ＜ 0.05或P＜0.01），表明小剂量、中剂量复方中药对免疫抑制小鼠非特异性免疫细胞因子IL-2及IFN-γ有免疫促进作用。见表4。

表4 各组NK细胞及细胞因子比较（%，x±s）

3 讨论

机体的免疫功能主要与T淋巴细胞和B淋巴细胞、单核巨噬细胞、NK自然杀伤细胞等免疫细胞及抗体、补体、免疫细胞产生的细胞因子有关。特异性免疫与T淋巴细胞、B淋巴细胞及B淋巴细胞活化产生的抗体有关，非特异性免疫与单核巨噬细胞、NK自然杀伤有关，而补体及细胞因子广泛参与特异性免疫与非特异性免疫。根据中医药理论和现代药理研究表明：西洋参补气养阴，清热生津，主要活性成分为皂苷类、多糖类和氨基酸类等，其中的活性多糖可以通过激活网状内皮系统、补体、激活巨噬细胞和T、B淋巴细胞，诱生多种免疫因子等途径对机体免疫产生广泛的影响，从而提高机体免疫力[4]；黄芪益气固表，能调节免疫功能，可治疗气虚感冒；枸杞滋补肝肾，能提高机体免疫功能，延缓抗衰老，长期服用可增强免疫功能；当归补血活血，具有抗炎和改善血管功能的作用[5]。本文以常用补益剂西洋参、黄芪、当归、枸杞组成的复方中药汤剂为研究对象，全方具有补气活血、滋补肝肾，滋阴益阳作用，观察其对免疫器官、免疫细胞、抗体、补体、细胞因子等不同层面免疫功能的影响，探求其增强免疫的机制。

正常对照组和模型对照组与各治疗组第1天的体重均值比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明随机分组成功。环磷酰胺为常有免疫抑制剂，为细胞周期非特异性细胞毒药物，其免疫抑制机制为对骨髓强大抑制作用，致T、B淋巴细胞绝对数量减少，并抑制淋巴细胞受特异性抗原刺激后母细胞的转化[6]。本实验采用其制作免疫抑制动物模型，实验结束后观察到体重、脾指数、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK 细胞、补体C3、细胞因子IL-2、IFN-γ均降低，且差异有统计学意义（P＜0.05），表明建立免疫抑制动物模型成功。模型对照组与各治疗组体重和脾指数无差异（P＞0.05），各复方中药治疗组对免疫抑制小鼠体重和脾指数无影响，表明其在免疫器官层面无显著性作用。脾指数模型对照组比正常对照组降低（P=0.0001），可能与促进免疫器官的生长作用因环磷酰胺对机体抑制作用过强而显现不出来有关。

本实验观察复方中药各剂量组与模型组比较对CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+均无差异，因此未能证实其对特异性细胞免疫及体液免疫有促进作用。以往有报道西洋参多糖对60℃射线照射致免疫抑制模型小鼠可增强Con A诱导的小鼠脾T淋巴细胞转化能力，增强小鼠迟发型变态反应能力[7]；黄芪多糖对正常小鼠可增强Con A诱导的小鼠脾T淋巴细胞转化能力[8]；当归多糖明显促进健康人外周血T淋巴细胞增殖[9]；枸杞多糖明显增强植物凝集素PHA活化的人外周血淋淋巴细胞的增殖[10]。复方中药中四种单味药均可促进T淋巴细胞免疫力，而组成的复方反而未得出促进T淋巴细胞免疫的结论，这可能与免疫模型不同引起药物对机体敏感性不同有关，还与观察T淋巴细胞指标不同及检测方法不同有关。

补体是存在于血清和组织液中经活化后具有酶活性的蛋白质，补体成分可与多种免疫细胞相互作用，调节细胞增殖、分化，补体C3等可参与固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈，参与免疫应答的诱导，并参与清除免疫复合物及免疫记忆，补体系统是具有重要生物学作用的效应级联放大系统。补体途径分为经典、替代和外源凝集素途径[11]，补体C3是补体激活的三个级联的一个关键组成部分[12]，因此本实验选择补体C3指标作为观察补体系统功能。低剂量中药组与模型对照组比较补体C3显著升高（P=0.0001＜0.01），表明低剂量中药组能显著升高免疫抑制小鼠补体C3浓度，显著促进免疫抑制小鼠补体系统的功能。

本实验免疫抑制模型对照组与正常对照组比较抗体IgG是升高的，差异有高度统计意义（P=0.002），而高剂量中药组、中剂量中药组、低剂量中药组IgG均值依次降低，且低剂量中药组与模型对照组比较，差异显著（P值=0.001），表明低剂量中药组能显著降低免疫抑制小鼠抗体IgG的浓度。机体抗原免疫后血清中的抗体其中IgM检出时间最早，IgG检出时间较晚但存留时间最长，IgA检出时间最晚[13]。本实验B淋巴细胞抗原CD19+在免疫抑制后下降，因IgG产生时间较晚但存留时间最长，在实验14 d的时间节点上，IgG主要是造模前存留的，因此理论上模型组与正常对照组应无统计学差异。通常抗原与抗体结合，在补体的参与下，抗原与抗体结合产生几何级联放大效应，清除抗原的同时消耗了抗体，补体升高会导致抗体降低，补体降低也会导致抗体升高。本实验免疫抑制后对补体也造成了强大的抑制，因而出现正常对照组IgG抗体低，模型组IgG抗体升高。本实验B淋巴细胞抗原CD19+各中药治疗组与模型组无差异，其一定程度上反映了机体体液免疫功能，体液免疫产生的抗体理论上亦无差异，因此认为低剂量中药组IgG降低是因为低剂量复方中药可显著升高补体所引起的。

NK自然杀伤细胞对病原体无严格选择性，能识别多种病原体的共有成分，对多种病原体均有吞噬、杀伤作用。NK细胞是产生细胞因子IFN-γ主要的先天免疫细胞，NK细胞不需要事先暴露于抗原发挥其功能，通过自然的细胞毒性和的分泌细胞因子发挥防止微生物的侵袭和传播的重要的免疫效应，NK细胞是天然免疫和获得性免疫功能之间的桥梁，先天第一线防御癌症和病原体的入侵的关键[14]。CD49是小鼠NK细胞主要标志物，本实验选用其作为观察NK细胞的功能指标。复方中药低剂量组与模型组比较可显著升高CD49（P=0.008＜0.01），显示低剂量复方中药能有效促进NK自然杀伤细胞数量。在此需要说明的是复方中药表现出的对机体免疫促进作用并不是由于中和环磷酰胺的药效而引起的，因为环磷酰胺的半衰期为4 h，24 h后已经过了6个半衰期，机体环磷酰胺的血药浓度仅有1/64，因此24 h后喂服中药不存在中和环磷酰胺的药效，表明小剂量复方中药对免疫抑制小鼠非特异性免疫NK细胞有免疫促进作用。

辅助性Th1细胞受抗原刺激分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，IL-2刺激CTL细胞增殖与分化，IFN-γ可诱导单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、星状细胞等MHCⅡ类抗原的表达，使其参与抗原提呈和特异性免疫的识别过程；IFN-γ还能增强巨噬细胞表面受体Fc的表达，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞[15]；IL-2和IFN-γ都可以增强NK细胞细胞毒活性。因此IL-2和IFN-γ是反映机体免疫功能的重要指标。本实验中剂量中药组及低剂量中药组与模型组比较均能升高IL-2和IFN-γ（P＜0.05），表明一定剂量范围的复方中药对免疫细胞因子有促进作用。

本实验复方中药药理毒理试验未发现明显毒副作用，但高剂量中药组对所有免疫指标均无促进作用，说明药物剂量过大对机体还是有一定的不利影响，中药中既使补益药，也有一定的副作用。虽然都是补气养阴活血的补益药，正应了中医理论有“气有余便是火”，补气有余易产生火邪。

因此，复方中药（由西洋参、黄芪、枸杞、当归等多味药组成）在一定剂量范围内，虽然还未能证实对机体特异性细胞免疫和体液免疫有促进作用，但对非特异性细胞免疫及体液免疫有显著促进作用。

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