苍耳子提取物对斑马鱼的发育及运动行为的毒性研究

陈锡强，侯海荣，刘可春，王希敏，彭维兵，韩利文，王雪，陈维云

（山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014）

苍耳子提取物对斑马鱼的发育及运动行为的毒性研究

陈锡强，侯海荣，刘可春*，王希敏，彭维兵，韩利文，王雪，陈维云

（山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014）

为研究苍耳子提取物对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响，取受精后12／24 h斑马鱼胚胎，将胚胎分别置于不同浓度苍耳子提取物溶液中，在作用不同时间后，显微镜下统计孵化率、死亡率和心率；取受精后120 h斑马鱼胚胎，用不同浓度苍耳子提取物处理60 min后，利用行为学分析系统统计各组斑马鱼在0～10、10～20、20～30 min内行为轨迹，基于游行距离与游行时间得到游行速度，并统计转圈值。结果表明，苍耳子提取物对受精后12 h斑马鱼胚胎的发育有毒性，使斑马鱼胚胎的孵化率降低，在提取物浓度大于15μg／mL时，孵化率低于40%；0.93μg／mL苍耳子提取物可提高24 h斑马鱼胚胎的心率（P≤0.01），当提取物浓度大于7.5μg／mL时，心率显著性降低（P≤0.01）；在行为学分析中发现，当苍耳子提取物浓度大于3μg／mL时，游行速度与转圈均值明显增加。研究认为，苍耳子提取物对斑马鱼胚胎发育有毒性作用，能够兴奋斑马鱼胚胎心率并增加其游行速度。

苍耳子；斑马鱼；发育；运动行为；毒性研究

Key words：Fructus Xanthii；zebrafish；grow th；motion behavior；toxicity

苍耳子为菊科植物苍耳（Xanthium sibiricumPatr.）的干燥成熟带总苞的果实，是临床常用中药材，多用于鼻病、过敏性疾病等的治疗。苍耳子临床应用历史悠久，其毒副作用也早有记载，《品汇精要》载苍耳子“味苦甘，性温，有小毒”。有文献报道患者误食苍耳子后发生中毒，引起神经毒性反应、肝肾损害和继发性脑水肿［1－2］。近年在苍耳子肝毒性作用机制、动脉平滑肌的损伤等方面都有新发现［3－4］，苍耳子毒性成分测定、炮制减毒方法［5］也取得了新的进展。本文研究了苍耳子水提取物对斑马鱼胚胎的发育及运动行为的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及其配制

苍耳子水提取物样品由四川省中医药研究院提供，其水溶性好，复溶后过滤，储液浓度为10 mg／m L，4℃保存备用。脱膜剂为链霉蛋白酶，购自北京索莱宝公司。三卡因购自Sigma公司，蒸馏水配制为1 mg／mL，4℃保存备用。

1.2 实验动物

实验用斑马鱼为AB系斑马鱼，鱼种取自山东省科学院斑马鱼药物筛选平台。斑马鱼的养殖和繁殖参照Westerfield法［6］。

1.3 发育毒性实验

取健康成熟的斑马鱼雌雄交配繁殖获得受精卵，纯净水冲洗3次后，再将受精卵移入胚胎培养用水中，28℃培养箱中继续发育。取受精后12 h胚胎随机分组，每组20只，设苍耳子提取物4.7、6.3、8.4、11.25、15、20μg／m L共6个浓度组和空白对照组，光照培养箱28℃培养至48 h，计算各组孵化率；取受精后24 h胚胎随机分组，每组20只，设苍耳子提取物0.93、1.85、3.75、7.5、15、30μg／m L浓度组和空白对照组，光照培养箱28℃培养至60 h后，用三卡因1 mg／mL实施麻醉后在XSJ2D型（Olympus公司）倒置显微镜下统计心率和死亡率。

1.4 行为学实验

根据斑马鱼行为学预实验结果，设定苍耳子提取物1.85、3.75、7.5、15、30μg／mL浓度组和空白对照组，24孔板每孔一只120 hpf胚胎，每个实验组6个胚胎，将24孔板放入培养箱孵育1 h，然后将24孔板放入斑马鱼行为学分析系统的暗箱中，使用zeblab软件分别采集10、20、30 min内各组总游行距离、游行时间和转圈值，其中游行速度由总距离／游行时间得到，各数值分别计入统计。

1.5 数据分析

采用数据统计软件SPSS对实验数据求均值，并进行样本组间多重比较。

2 结果与分析

2.1 多浓度苍耳子水提取物对斑马鱼的发育毒性

苍耳子水提取物对12 h卵膜内斑马鱼的发育有毒性反应，随着浓度增加，斑马鱼胚胎的孵化率降低，大于15μg／m L时孵化率低于40%（图1）；发育24 h的斑马鱼胚胎死亡率随着浓度的增加逐渐增加，在15μg／m L时，死亡率增加明显，高浓度组出现心脏积液，翘尾等畸形（图2～3）。实验结果显示，0.93μg／mL低浓度苍耳子提取物可显著性地提高心率，当浓度大于7.5μg／mL时心率出现显著性降低（图4）。

2.2 多浓度苍耳子水提取物对斑马鱼运动行为的影响

在30 min行为轨迹分析中，3.75μg／mL以上浓度药物组与对照组比较随着浓度的增加，斑马鱼胚胎游行速度明显提高；转圈均值也显著增加（图5～6），在浓度大于3.75μg／m L时尤为明显，30μg／m L浓度组在30 min内转圈均值出现明显下降趋势（图7）。

图1 苍耳子水提取物对斑马鱼胚胎孵化率的影响Fig.1 Impact of FX extract on hatch rate of zebrafish embryos

图2 苍耳子水提取物对斑马鱼胚胎死亡率的影响Fig.2 Impact of FX extract on mortality rate of zebrafish embryos

图3 苍耳子水提取物对斑马鱼胚胎发育影响Fig.3 Impact of FX extract on the growth of zebrafish embryos

图4 苍耳子水提取物对斑马鱼胚胎心率的影响Fig.4 Impact of FX extract on heart rate of zebrafish embryos

图5 苍耳子水提取物对斑马鱼游泳速度的影响Fig.5 Impact of FX extract on swimming speed of zebrafish embryos

图6 苍耳子水提取物对斑马鱼转圈值的影响Fig.6 Impact of FX extract on rotation value of zebrafish embryos

图7 苍耳子水提取物对斑马鱼行为轨迹的影响Fig.7 Impact of FX extract on behavior track of zebrafish embryos

3 讨论

由于中药材多以复方应用于临床，使得其毒副作用在长期的临床应用中往往被忽视。近年来随着对中药材研究的逐步深入，关于中药材及中成药毒副作用的报道逐渐增多，增进了对中药材的毒副作用的认识，毒性研究促使其应用更加的安全规范，对于拓展中药材尤其有毒中药的应用有深远的意义。

斑马鱼作为一种新型模式动物，具有许多与众不同的特点，例如产卵量多、繁殖周期快且易于饲养，前期胚胎整体透明［7－8］，斑马鱼的基因图谱基本清晰且与人类相似。因此，斑马鱼在行为学中的应用前景逐渐被研究者所认识［9－11］。行为学检测是一种比较经济、便捷和有效的方法，在相应软件的帮助下，行为学实验不仅变得简单快捷，而且可以定量或是高通量地研究成瘾性、学习、失眠以及焦虑抑郁等行为学改变。

有报道指出苍耳子中的苍术苷（atractyloside）与羧基苍术苷（carboxyatractyloside）是主要的毒性成分，也是活性成分，已发现其包括急性与亚急性毒性、肝肾损害、细胞毒性等毒性反应［12－13］，但对于神经系统的作用尚未见报道。本实验研究了苍耳子提取物对斑马鱼的毒性作用，发现随着浓度的增加和斑马鱼胚胎出现孵化率降低、死亡率增加、心脏畸形等毒性体征，提示苍耳子对于斑马鱼发育及循环系统发育有明显毒性。在行为学研究中发现，苍耳子提取物具有兴奋作用，随着浓度增加，游行速度、转圈值均明显增加；随着时间延长，速度出现下降趋势，但仍高于对照组。提示苍耳子提取物对神经系统有一定兴奋作用，这种作用是单纯神经毒性或者是整体毒性的反应还需要更深入的实验研究。斑马鱼行为分析可以减为中药神经系统毒性研究的快捷研究手段，有利于中药新毒性的发现，对于全面地了解有毒中药的副作用大有益处。

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Toxicity of Fructus Xanthii extract to the growth and motion behavior of zebrafish embryos

CHEN Xi-qiang，HOU Hai-rong，LIU Ke-chun*，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，HAN Li-wen，WANG Xue，CHEN Wei-yun
（Shandong Provincial Key Labo ratory of Biosensors，Biology Institu te，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

We put 12／24h zeb rafish emb ryos after fertilization into the solution of different concentrations Fruc tus Xanthii（FX）to investigate the toxicity of FX extract to the grow th andmotion behavior of zebrafish embryos．We then calculate their hatch rate，mortality rate，and heart rate under a mic roscope after different time．We treat120 h zeb rafish embry of or 60 minutes with different concentrations FX extrac t，and then recordtheir behavior track within 0～10 m，10～20 m，and 20～30 mw ith ethology analysis system．We also get sw imming speedbasedon their sw imming distance andtime andtheir rotation value．Results show that FX extrac t has toxicity to 12 h zeb rafish emb ryos after fertilization，which decrease their hatch rate．The hatch rate is below 40%when the extrac t concentration is greater than 15μg／mL．FX extract of 0．93μg／mL can inc rease the heart rate of 24 h zeb rafish emb ryos（P≤0．01）．We discover that sw imming speedandrotation value all significantly increase when the extract concentration is greater than 3μg／mL through ethology analysis．Our conclusion is that FX extrac thas toxicity to zeb rafish embryos and can inc rease their heart rate ands wimming speed．

R965.1；R932；R944

A

1002-4026（2014）05-0009-05

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.002

2014-06-20

国家自然科学基金（81202584）；山东省科技攻关项目（2011GHY11505）

陈锡强（1972－），男，博士，研究方向为药理学。Email：cxqq＠sina.com

*通讯作者，刘可春，男，博士，研究方向为药物筛选。Email：hliukch＠sdas.org