山羊痘活疫苗病毒含量测定与用羊效力检验相关一致性改进对比试验

何玉仙，康广平，鲁立柱，黄 炯

（1.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032 2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

山羊痘活疫苗病毒含量测定与用羊效力检验相关一致性改进对比试验

何玉仙1，康广平1，鲁立柱1，黄 炯2

（1.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032 2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

近两年本公司山羊痘活疫苗成品分别采用病毒含量测定和效力检验，病毒含量测定达到《兽用生物制品制造与检验规程》标准，效力检验出现痘型小、不明显，持续时间短，与《兽用生物制品制造与检验规程》中规定有差异。针对此现象,本公司通过增加种毒羊睾丸细胞营养液、提高单位体积内病毒含量培养、收获毒液，达到病毒含量测定达标且效力检验中痘型大、明显、且持续时间长，与规程表现出较好的相关一致性。

病毒含量测定；效力检验；痘型大小；持续时间

山羊痘是由山羊痘病毒属山羊痘病毒引起的一种高度接触性、病毒性传染病。其特征为发热、呼吸困难、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，是家畜中最严重的一种痘病，发病率达50%～80%，病死率达20%～75%，给养殖业带来较大危害。治疗山羊痘病毒无特效药，目前主要用山羊痘弱毒疫苗预防。我公司利用1～3月龄绵羊睾丸制备细胞生产山羊痘活疫苗已有近三十年历史，生产工艺成熟，产品质量稳定，效力检验用病毒含量测定与羊检验两种方法均表现出与《兽用生物制品制造与检验规程》较好的相关一致性。但近两年生产的山羊痘活疫苗在病毒含量测定和用羊检验两方法进行效力检验时，出现病毒含量测定达到标准，用羊检验痘型小、不明显，持续时间短的问题，给生产带来困惑。为探究本问题，2011年起本公司生产人员从种毒病毒含量测定与最小发痘量是否一致性上，探究生产毒液的病毒含量测定与痘型是否与种毒有关，同时针对其差异，2012年从种毒细胞营养液、增加单位体积内接毒量、接毒后维持液量与以往比减少方面进行改进，最终使种毒及生产毒液病毒含量测定与用羊检验表现出较好的相关一致性，达到规程规定。

1 种毒及复壮种毒病毒含量测定与最小发痘量相关一致性对比试验

1.1 试验材料

1.1.1 羊睾丸来源

乌鲁木齐市郊区永丰乡3月龄内健康雄性羔羊。

1.1.2 种毒来源

2011年生产使用AV41 0.5 mL/支（2008.9.26）1支，购自中国兽医药品监察所。

2012年生产使用AV41 0.5 mL/支（2008.9.26）1支，购自中国兽医药品监察所；AV41（2008.9.26，购自中国兽医药品监察所）繁殖一代细胞冻干毒（2010年6月22日自备冻干）1 mL/瓶*3瓶。

1.1.3 主要器材和设备

冰箱（海尔BCD216TDZA）、倒置显微镜（OLYPUS公司生产的BDS-300）、克氏瓶、15 000 mL血清瓶、96孔细胞板。

1.1.4 试验动物

山羊，购自新疆米泉市未患山羊痘、未接种过羊痘疫苗的山羊。

1.2 试验方法

1.2.1 2011年及2012年种毒繁殖复壮毒液毒价测定对比试验

将冻干种毒按含毒组织量用乳汉液10倍稀释，按细胞生长液的1%～2%（2011年每只干毒接2个克氏瓶，2012年每只干毒接1个克氏瓶），接种至绵羊睾丸单层细胞培养良好的克氏瓶、细胞瓶中，37℃吸附1 h，倾去毒液（接种湿毒不倾毒），加入细胞维持液（2011年接毒量维持在1.5%～2.0%，转瓶维持液量在1 400～1 500 mL/瓶，2012年接毒量维持在2.7%～3.0%，转瓶维持液量在1 000～1 100 mL/瓶），置37℃培养、观察，待细胞产生以圆缩为特征的病变时收获毒液并测定毒价[1]。

本实验2011年生产用1支干毒分别复壮了3代基础种毒毒液；2012年生产用1支干毒、一支自备冻干毒分别复壮了3代基础种毒毒液，病毒含量测定结果如表1、表2。

表1 2011年生产用种毒及基础毒液病毒含量测定结果统计

表2 2012年生产用种毒及基础毒液病毒含量测定结果统计

1.2.2 2011年及2012年毒种繁殖复壮各代次最小发痘量对比试验

用生理盐水将毒种及复壮毒液按含毒组织量做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-53个稀释度，每个滴度胸腹部皮内注射1～4岁健康易感山羊3只（本实验是在每只羊体上同时注射10-3、10-4、10-53个滴度），每个滴度2颗，每颗0.5 mL。观察15 d，其10-4、10-5稀释度至少应有一只羊发痘[1][2]。对比试验结果如表3、表4。

表3 2011年生产用种毒及复壮基础毒液羊体最小发痘量统计表

表4 2012年生产用种毒及复壮基础毒液羊体最小发痘量统计表

1.2.3 2011年、2012年毒种及复壮毒液小结

1.2.3.1 病毒含量测定 无论是2011年所用1支干毒，还是2012年所用两支干毒 （其中一支为自备毒），在羊睾丸单层细胞上复壮一代时，每0.1 mL病毒含量均达到104.5TCID50以上。复壮到第三代时，每0.1 mL病毒含量均达到105.0TCID50以上，毒价一代比一代高，呈现递增趋势，符合病毒传代规律，达到规程规定。试验显示病毒含量与单位体积内所接毒液含量多少无关。

1.2.3.2 最小发痘量检验结果 2011年所用中检所干毒及复壮种毒在羊体上10-3稀释度全部发痘，10-4稀释度至少有两只山羊发痘，10-5稀释度至少有一只山羊发痘，符合规程规定。但无论哪个稀释度，在羊体上均表现痘型小、持续时间短（痘型直径在0.6 cm左右，大多持续时间在1.5 d以内），与2009年前用G42-56（1995.6.14）或G14-STV44-55（2003.03.12）种毒生产表现出的痘型大,持续时间长（痘型直径在1.5～3 cm左右，痘型持续在4～6 d左右）有较大差异。

2012年所用中检所与自备冻干毒及复壮种毒在增加每瓶接毒含量、减少每瓶维持液量上做改进，在羊体上10-3稀释度全部发痘；10-4稀释度至少有两只山羊发痘；10-5稀释度至少有一只山羊发痘，符合规程规定。2012年生产无论哪个稀释度，在羊体上表现痘型大、持续时间长，（痘型直径在1.5～1.8 cm左右，持续时间维持在4～5 d左右），基本接近2009年以前生产出现的痘型和持续时间，说明种毒在复壮过程中增加每瓶接毒含量、减少每瓶维持液量可在痘型反应上表现出与病毒含量测定较好的一致性。

注：2009年前用G42-56（1995.6.14）或G14-STV44-55（2003.03.12）种毒繁殖及其复壮，其接毒量和维持液量与2011年生产过程相同。

2 生产毒液、成品病毒含量测定与羊体检验相关一致性对比试验

2.1 试验材料

羊睾丸（来自乌鲁木齐市永丰乡郊区3月龄内健康雄性羔羊）、犊牛血清（兰州民海、内蒙金源康）、MEM（Gibco）、乳汉液（本公司自制）等。

2.2 主要器材和设备

倒置显微镜（OLYPUS公司生产的BDS-300）、剪刀、镊子、15 000 mL血清瓶、移液枪、96孔细胞板等。

2.3 试验动物

山羊，购自新疆米泉市未患山羊痘、未接种过羊痘疫苗的山羊。

2.4 试验方法

2.4.1 2011年及2012年生产毒液病毒含量测定对比试验（见表5）

按山羊痘活疫苗细胞制备、接毒、收获操作规程生产毒液，只改变每瓶接毒含量及每瓶维持液量，毒液收获后各批次毒液混匀后取样测定毒价，生产毒液放置-15℃冷库保存备用。

表5 2011年及2012年生产毒液病毒含量测定结果对比表

2.4.2 2011年及2012年成品病毒含量与羊体检验相关性对比试验

本试验随机抽取本公司生产毒液各4批 8个小样，2011年、2012年分别按每瓶冻干病毒含量1.1 mL，每瓶冻干分装量2.2 mL冻干后，按《中华人民共和国兽药典》2010版进行病毒含量测定与羊检验，结果见表6。

表6 2011年及2012年生产毒液冻干后病毒含量测定与用羊检验结果对比表

2.4.3 2011年及2012年生产用毒液检验小结

生产用毒液及冻干后样品病毒含量测定无论是2011年生产还是2012年生产，每瓶接毒含量、接毒后维持液量增加或减少后，冻干前后毒价无明显差异，均达到兽用生物制品规定，符合标准。

生产毒液用羊检验，显示2012年生产毒液痘型大小及持续时间明显高于2011年生产毒液，与兽用生物制品规程更趋于一致，即2012年生产毒液病毒含量测定与用羊检验相关一致性优于2011年生产毒液，接近2009年前生产毒液用羊检验的痘型和持续时间。

3 讨 论

《兽医生物制品制造与检验规程》2000版、《中华人民共和国兽兽药典》2010版三部规定，山羊痘活疫苗生产中成品苗检验选取病毒含量测定与用羊检验中的任一方法均可。本试验中无论种毒还是生产用毒病毒含量测定均可达标，用羊检验却表现与规程规定有差异，因此本文讨论的病毒含量测定与用羊检验的相关一致性是指同时符合这两个条件的效力检验。

一般来说，用羊检验不应在羊体表现全身发痘，同时痘肿不应出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂、全身严重反应等现象，而应在注痘部位出现直径0.5～3.0 cm微红色或无色痘肿反应，且持续4 d以上逐渐消退，发痘羊间或可有轻度体温反应，但精神食欲应正常。 王绍华等《山羊痘弱毒疫苗的研究（第一报）（第二报）中以此表示毒株毒力稳定、安全性、免疫原型良好。但本文中2011年生产种毒及毒液在羊体上均表现痘型小或不明显，在规程规定下限、持续时间仅有1～1.5 d，与规程规定有差异，也就意味生产毒株毒力弱或免疫原型不良[3][4]。

增加单位体积内的接毒量培养收获的病毒液，无论种毒还是生产毒液用病毒含量测定无明显差异，均在规程规定范围，但在用羊检验上表现出1.9～2.3 cm的痘型，持续时间长（达4 d以上，相对于2011年而言），更符合规程规定，说明在实际生产中通过增加单位体积的病毒含量培养病毒，在羊体上是可以达到规程规定的痘型大小及持续时间，换言之，能增强山羊痘活疫苗的免疫原性[3][4]。

本公司在2012年生产中，注重种毒的繁殖复壮，改变以往种毒繁殖一直用乳汉液为现今的MEM-水解乳蛋白液，使种毒在繁殖复壮时营养液优于往年，虽然在病毒含量测定上未与往年显现明显差异，但在羊体痘型和持续时间上达到规程规定，说明种毒繁殖复壮营养条件的改变对后续生产毒液病毒含量测定无明显影响，但用羊检验上会在痘型大小、持续时间长短上有影响。

生产过程反复验证，1～3月龄绵羊羔睾丸最适合制备生长良好的致密单层细胞，绵羊羔超过3月龄、羊睾丸过大、净重超过20 g，细胞生长形成的单层不致密，贴壁细胞不均匀，每平方单位内的有效细胞数少，收毒量少，毒价低，对产品免疫原性有影响，本文是在确保此生产条件下进行的病毒含量测定与用羊检验试验[5]。

在今后生产中，制备致密、生长良好的羊睾丸单层细胞；用MEM-水解乳蛋白营养液制备细胞、增加单位体积内的接毒量培养收获病毒液，是增强山羊痘活疫苗成品用羊效力检验痘型大小、持续时间长短的有效措施，能使病毒含量测定与用羊检验保持其较好的相关一致性，使产品更能符合规程规定，达到较好的免疫效果。

[1]中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程[M].北京：化学工业出版社，2000：46-148.

[2]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（2010版三部）[M].北京：中国农业出版社，2010：61-62.

[3]王绍华,江焕贤.山羊痘弱毒疫苗的研究(第一报)山羊痘弱毒细胞株的培育[J].兽医药品通讯，1984，(02).

[4]王绍华,江焕贤.山羊痘弱毒疫苗的研究(第二报)山羊痘弱毒细胞培养冻干疫苗的研究[J].兽医药品通讯，1985，(02).

[5]康广平,符子华,蒋晓玲,等.羔羊睾丸大小对山羊痘细胞苗生产的经济影响[J].新疆农业科学，2004,(S1).

The Comparative Tests for the Assay of Goat Pox Living Vaccine and its Potency

HE Yu-xian1，KANG Guang-ping1，LU Li-zhu1，HUANG Jiong2
（1.Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830032，China；2.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000,China）

In the past two years the company live goat pox vaccine production optional one method of?the virus content determination and the efficacy test,the virus content reach the standard"veterinary biological products manufacturing and inspection procedures",but efficacy test appear small pox,not obvious,time is short.Against this phenomenon of the company by increasing the seed virus of sheep testis cell nutrient fluid to improve viral content per unit volume,harvested venom achieved viral load determination of compliance and effectiveness testing of smallpox in large,obvious,and lasts long,associated with the procedures demonstrated a good deal of consistency.

virus content determination；efficacy test；pimple size；duration

S852.65+4文献标识码：A文章编号：1003-6377（2014）04-0048-05

2014-03-20

何玉仙（1967-），女，兽医硕士，兽医师职称，从事兽用疫苗生产。