真武汤调节肾间质纤维化大鼠NF-κB表达的研究

宋立群，周波，贠捷，宋业旭，马晓鹏，于思明，代丽娟，马艳春

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科，哈尔滨 150040；2.四川省达州市中西医结合医院；3.黑龙江中医药大学）

·基础研究·

真武汤调节肾间质纤维化大鼠NF-κB表达的研究

宋立群1，周波2，贠捷3，宋业旭3，马晓鹏1，于思明1，代丽娟1，马艳春3

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院肾病科，哈尔滨 150040；2.四川省达州市中西医结合医院；3.黑龙江中医药大学）

目的研究真武汤对NF-κB蛋白表达的影响，从分子水平对真武汤治疗肾间质纤维化的机制进行探索。方法采用单侧输尿管结扎的方法（UUO）制备大鼠肾间质纤维化模型，将150只SPF级健康雄性wistar大鼠，随机分为假手术组、模型组、尿毒清组以及真武汤低、中、高剂量组。术后2周、3周、4周分别处死大鼠，收集尿液、血清，结扎单侧肾组织，对24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮含量进行检测，分别用免疫组织化学法、ELISA法检测NF-κB的表达。结果在各时间点，真武汤各给药组与模型组相比，大鼠梗阻侧肾脏肿大和积水程度较轻，血肌酐、尿素氮含量较低，肾组织和血清中NF-κB蛋白表达均较弱。结论真武汤可减少间质纤维化，减轻肾组织损伤，其延缓肾间质纤维化进程的作用机制可能是通过抑制NF-κB的表达来实现的。

肾疾病；纤维化；NF-κB；大鼠，Wistar

肾间质纤维化（RIF）和肾小球硬化是形成终末期肾病的重要原因之一，但其机制尚未完全阐明。故研究中药防治RIF的作用机制，能为中医药治疗终末期肾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择150只SPF级健康雄性Wistar大鼠，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，体质量180～200 g。

1.1.2 实验药物 真武汤方，参考第5版《方剂学》教材，即炮附片、茯苓、白芍、生姜各9 g，白术6 g。将此剂量设为正常成人60 kg体质量的1日剂量，根据成人每日用量42 g（1剂中药），在前期预实验的基础上，以正常人60 kg体质量用药剂量的10倍为低剂量，20倍为中剂量，40倍为高剂量，即分别为7 g·kg-1·d-1、14 g·kg-1·d-1、28 g·kg-1·d-1。由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制备真武汤汤剂。

尿毒清颗粒（广州康臣药业有限公司产）。根据文献剂量，大鼠使用尿毒清的剂量为3.75 g·kg-1·d-1。

1.2 方法

1.2.1 分组 将150只大鼠，随机分为假手术组（A组21只）和造模组，其中造模组大鼠又分为五组，模型组21只（B组），真武汤低27只（C组）、中27只（D组）、高剂量组27只（E组）和尿毒清颗粒对照组27只（F组）。采用UUO的方法复制大鼠RIF模型，假手术组仅切开腹腔并游离左侧输尿管，不做输尿管结扎。

1.2.2 给药方法 于术后第1天开始灌胃，用药如下：A组、B组予蒸馏水；C组：予低剂量真武汤水煎液；D组：予中剂量真武汤水煎液；E组：予高剂量真武汤水煎液；F组：予0.15g／ml尿毒清药液。每日1次。

1.2.3 标本采集和检测 分别在术后第2、3、4周前一天将大鼠放置代谢笼中收集尿液，检测24小时尿蛋白定量；取大鼠股动脉血，分离血清用于检测肌酐、尿素氮的含量，ELISA法测定NF-κB的表达；取结扎侧肾组织，HE染色后于光镜下观察肾脏病理改变，免疫组织化学法来检测肾组织中NF-κB的表达。

1.3 统计学处理 实验结果用SPSS 15.0统计软件处理，组间数据的比较用单因素方差分析，多重数据比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h尿蛋白定量的变化 见表1。

2.2 鼠血肌酐、尿素氮的变化 见表2，3。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白含量结果（±s，mg／24h）

表1 各组大鼠24 h尿蛋白含量结果（±s，mg／24h）

注：各组2周、3周、4周比较，P＞0.05

组别鼠数（只）2周3周4周假手术组6 15.76±1.40 16.13±1.59 15.65±1.35模型组6 15.89±1.47 15.78±1.56 16.17±1.57真武汤低剂量组8 16.02±1.52 15.96±1.49 16.05±1.59中剂量组8 15.97±1.48 16.10±1.53 16.06±1.55高剂量组8 16.07±1.56 15.83±1.42 15.96±1.47尿毒清组8 15.97±1.48 16.12±1.55 15.89±1.53

表2 真武汤对大鼠血清肌酐含量的影响（±s，μmol／L）

表2 真武汤对大鼠血清肌酐含量的影响（±s，μmol／L）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，dP＜0.01；尿毒清组与真武汤中剂量组比较，cP＞0.05

组别鼠数（只）2周3周4周假手术组6 36.52±5.37 36.78±6.54 36.45±5.86模型组6 98.61±10.07a81.53±8.02a87.36±8.97a真武汤低剂量组8 94.34±9.51 75.68±6.86b77.62±7.99b中剂量组8 84.49±7.98b62.84±6.01d65.29±6.15d高剂量组8 88.61±8.56b69.65±6.52b73.56±5.97b尿毒清组8 82.87±8.19bc63.52±5.96bc64.53±6.02dc

表3 真武汤对大鼠血清尿素氮含量的比较（±s，mmol／L）

表3 真武汤对大鼠血清尿素氮含量的比较（±s，mmol／L）

注：与假手术组比较，dP＜0.05，aP＜0.01；与模型组比较，eP＜0.01；与真武汤中剂量组比较，cP＞0.05

组别例数2周3周4周假手术组6 7.95±1.02 8.23±0.95 8.15±0.89模型组6 16.69±1.67a13.37±1.62d14.53±1.47a真武汤低剂量组8 15.52±1.51 12.65±1.42b14.23±1.63b中剂量组8 14.51±1.53b11.32±1.26e12.77±1.26b高剂量组8 14.13±1.67b12.28±1.34b13.15±1.58b尿毒清组8 14.37±1.55bc11.30±1.42bc11.85±1.35bc

2.3 肾脏组织NF-κB蛋白表达的影响 见表4。

2.4 真武汤对血清中NF-κB蛋白表达的影响 见表5。

3 讨论

活化的NF-κB可诱导转录多种因子，包括细胞因子（如干扰素-β、肿瘤坏死因子-α、白介素等）、趋化因子（如单核细胞趋化因子-1、巨噬细胞炎性蛋白-1α等）、黏附因子（如血管细胞黏附分子-1、细胞间黏附分子-1等）、补体、免疫受体、生长因子、转录因子等［1-3］。因此，NF-κB参与感染、炎症、免疫应答、应激、细胞的增殖和凋亡等病理过程，在很多疾病的发病机制中起到中心调节的作用［4］。在RIF过程中NF-κB主要作用包括：第一，参与调控多种炎症因子的表达，导致单核／巨噬细胞浸润，肾组织炎症并纤维化；第二，参与细胞产生各种致纤维化细胞因子；第三，促成纤维细胞增生、分化。总之，NF-κB是RIF各种通路的共同作用点，抑制其活性并抑制其调控其他因子的转录已成为抗肾纤维化治疗的关键点。

表4 各组肾组织NF-κB免疫组织化学表达量比较（±s，平均光密度×10-2）

表4 各组肾组织NF-κB免疫组织化学表达量比较（±s，平均光密度×10-2）

注：与假手术组比较，aP＜0.05，cP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，dP＜0.01；与真武汤中剂量组比较，eP＜0.05

组别视野数2周3周4周假手术组10 12.34±1.02 12.21±1.15 12.26±1.19模型组10 15.24±1.35a18.56±1.68c23.76±1.89c真武汤低剂量组10 13.92±1.11b17.25±1.72b19.47±1.83b中剂量组10 12.05±0.98b14.37±1.26d15.16±1.41d高剂量组10 13.64±1.02b16.48±1.53b18.51±1.80b尿毒清组10 12.73±1.14b14.65±1.32d16.86±1.47be

表5 各组大鼠血清中NF-κB蛋白表达的比较（±s，ng／m L）

表5 各组大鼠血清中NF-κB蛋白表达的比较（±s，ng／m L）

注：与假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，dP＜0.01；与真武汤中剂量组比较，cP＞0.05

组别例数2周3周4周假手术组6 128.35±10.50 126.75±10.62 127.82±11.36模型组6 284.56±23.61a328.46±28.63a356.53±30.65a真武汤低剂量组8 268.66±25.43b296.72±25.83b319.71±30.69b中剂量组8 231.29±22.26b250.37±20.64d265.96±25.53d高剂量组8 259.67±23.46b278.51±22.35b286.65±25.76d尿毒清组8 239.52±19.64bc256.76±24.65bc268.49±23.92cd

真武汤一方出自汉·张仲景所著的《伤寒论》。《伤寒来苏集》谓“真武，主北方水也。坎为水，而一阳居其中，柔中之刚，故名真武。是阳根予阴，静为动本之义”；《伤寒明理论》谓“真武，北方水神也，而属肾，用以治水焉”。真武汤全方共五味药物，辛温壮肾之附子，温燥健脾之白术、茯苓，辛散利水之生姜，合里益阴之芍药，全方意在温阳而化水。药理研究证明，真武汤具有保护肾功能、强心利尿、改善血脂等作用。应用真武汤治疗肾小球肾炎、肾病综合征、慢性肾功能衰竭、糖尿病肾脏疾病等肾脏系统疾病均有报道［5］。

本实验中，各组大鼠24 h尿蛋白定量比较无意义，这与其他实验报道结果一致，推测与UUO模型大鼠肾纤维化病变明显，肾小球几乎不受影响有关。本实验中模型组及给药组大鼠肌酐、尿素氮含量在各时间点均高于假手术组，给药组肌酐、尿素氮含量均低于模型组，其中真武汤中剂量组和尿毒清组最低，说明真武汤和尿毒清均有较明确的肾功能保护的作用。大鼠血清和肾组织中NF-κB蛋白含量结果显示，真武汤各剂量组和尿毒清组与造模组比较均较低，说明真武汤和尿毒清组均可抑制大鼠血清和肾组织中NF-κB蛋白的表达。本实验说明真武汤能够降低UUO模型大鼠血肌酐、尿素氮水平，其作用机制可能是通过抑制NF-κB的表达来实现的。

［1］Sen R，Baltimore D.Inducibility of κ immunoglobulin enhancer-binding protein NF-κB by a posttranslational mechanism［J］.Cell，1986，47（6）：921-928.

［2］Henning B，Toborek M，Oshi Barve S，et al.Linoleic acid activates-nuclear transcription factor-kappa B（NF-kappa B）and induces NF-kappa B dependent transcription in culturedendothelial cells［J］.Am Clin Nutr，2000，63 （3）：322-328.

［3］Guijarro C，Egido.Transcription factor-kappa B（NF-kappa B）and renal disease［J］.Kidney Int，2001，59（2）：415-424.

［4］Dutta J，Fan Y，Gupta N，et al.Current insights into the regulation of programmed cell death by NF-κB［J］.Oncogene，2006，25（51）：6800-6816.

［5］刘彩香，郭立中.真武汤在慢性肾脏病中的研究概况［J］.中医研究，2008，21（4）∶61-64.

Effect of Zhenwu decoction on nuelear factor kappa B expression in renal tubu lointerstitial fibrosis in unilat-eral ureteralobstruction（UUO）rats

SONGLiqun*，ZHOU Bo，YUN Jie，SONGYeχu，MA Xiaopeng，YU Siming，DAI Lijuan，MA Yanchuan（*Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital to Heilongjiang University of TCM，Harbin 150040，China）

MA Yanchuan，Email：yanchunma＠163.com

ObjectiveTo investigate the effect of Zhenwu decoction on nuelear factor kappa B expression of renal tubulointerstitial fibrosis in unilateral ureteralobstruction（UUO）rats，and to explore the mechanism of the Zhenwu decoction for treating renal interstitial fibrosis.Methods The renal interstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction in rats was prepared.The 150 male wistar rats were randomly divided into six groups：sham operation group（n＝21），UUO group（n＝21），low-dosage of Zhenwu decoction group（n＝27），medium-dosage of Z henwu decoction group（n＝27），high-dosage of Zhenwu decoction group（n＝27）and Niaoduqing granules group（n＝27）.The rats were given daily by gavage starting one day after operation.A part of rats in each group were sacrificed respectively at 2th、3th、4th week after operation.The 24h urine and serum were collected，and the ligation of Unilateral kidney tissues was conducted.The level of 24 hour urinary protein，serum creatinine（Scr），blood urea nitrogen （BUN）were detected，and the expressions of NF-κB were observed by immunohistochemical method and ELISA.ResultsThe levels of serum Scr and BUN in Zhenwu decoction groups were lower than those in UUO group at each indicated time points.The expression of NF-κB in blood and renal were much lower than that in the Zhenwu decoction groups.Conclusion The Zhenwu decoction could delay the progression of renal interstitial fibrosis，which may be involved in the decrease of NF-κB expressions in UUO rats.

Kidney Diseases；Fibrosis；NF-kappa B；Rats，Wistar

R692

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.024

2013-09-15）

黑龙江省教育厅科学技术项目（12511519）

宋立群，主任医师，教授，博士生导师，Email：qunli＠sina.com

马艳春，副教授，硕士生导师，Email：yanchunma＠163.com