人乳腺癌特异性基因1 m RNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测试剂盒的建立及应用

程民，沈国栋，卞庚，徐婷娟，徐维平，沈干，3，胡世莲

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省老年医学研究所；3.肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室）

·基础研究·

人乳腺癌特异性基因1 m RNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测试剂盒的建立及应用

程民1，2，3，沈国栋1，2，3，卞庚2，徐婷娟1，3，徐维平1，沈干2，3，胡世莲1，2，3

（1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省老年医学研究所；3.肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室）

目的建立人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）检测试剂盒，并评价其在乳腺癌循环肿瘤细胞检测中的应用价值。方法优化试剂盒中各组分的浓度、确定试剂盒的稳定性、灵敏度及特异性，并检测外周血样品中BCSG1 mRNA的表达水平。结果优化了试剂盒中的引物、探针，成功制备了定值标准品，通过设立阴、阳性质控品的方法，解决了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等关键技术问题，特异度及准确性均为95%以上，灵敏度为100拷贝／ml（全血）。外周血标本中BCSG1 mRNA的检测结果为，12例临床确诊已转移的乳腺癌患者均为阳性，21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性，其余9例为阴性，15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性。结论建立的BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有很高的临床应用价值，可用于检测外周血样品中BCSG1 mRNA的表达量，检测结果可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。

乳腺肿瘤；试剂盒，诊断；RNA，信使；逆转录聚合酶链反应

乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率明显增高，2012年，我国乳腺癌发病率为42.55／10万，居女性恶性肿瘤的第一位。目前，乳腺癌手术切除是其主要治疗措施，但术后复发和转移已成为阻碍患者生存期提高的主要原因。外周血中循环肿瘤细胞的检测，特别是肿瘤基因标志物mRNA的定量测定，有利于乳腺癌转移和复发的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。乳腺癌特异性基因1 （BCSG1）是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其在乳腺癌组织中存在特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是一种与乳腺癌进展有关的肿瘤基因标记物。因此，建立乳腺癌患者外周血中BCSG1 mRNA检测试剂盒，并将其应用于临床诊断，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察等具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 外周血标本 在本研究中，我们由安徽省立医院、安徽医科大学第一附属医院及合肥市第一人民医院共收集乳腺癌患者外周血标本33份，其中12份为临床上已确诊远端转移的标本；乳腺增生及乳腺炎患者外周血标本15份；正常人外周血标本10份。

1.1.2 总RNA提取、逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）试剂 Trizol试剂购于Invitrogen公司，异丙醇、氯仿、无水乙醇等分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司，焦碳酸二乙酸钠（DEPC）购自BIOBASIC（BBI）公司。逆转录试剂盒、dNTPmix （10mM）、OligdT18、Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，荧光定量PCR试剂购自Invitrogen公司，BCSG1上游引物：5’-GGGTGA GGC ATC CAA AGA GA-3’；下游引物：5’-TGGGCA GCC GCA TGT C-3’；探针：5’-FAM-AGA GGA AGT GGC AGA GGA GGC CCA-TAMRA-3’；β-actin上游引物：5’-TTGCCGACA GGA TGC AGA A-3’；下游引物：5’-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT-3’；探针：5’-FAM-TCA TTGCTC CTC CTGAGC-TAMRA-3’；上述引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.3 核酸电泳检测试剂 琼脂糖购自Spanish公司，Tris试剂购自Amresco公司，乙酸、硼酸、EDTA购自国药集团化学试剂有限公司，溴化乙锭（EB）购自Amresco公司，6×上样缓冲液购自大连宝生物工程有限公司，100bp DNA ladder购自Fermentas公司。

1.1.4 细胞株、培养基 K562细胞（rythroleukemia cell line）和SK-BR-3细胞（breast ademocarcinoma cell line）购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI 1640、DMEM干粉培养基购自Gibco公司，碳酸氢钠（分析纯）、二甲基亚砜（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司，胎牛血清购自上海依科赛生物制品有限公司，胰蛋白酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.5 菌株、载体及质粒制备试剂 大肠杆菌DH5α（感受态）由本室保存；T-载体（pMD18-T Vector）购自大连宝生物工程有限公司，PCR产物纯化试剂盒购自Promega公司，质粒（小量）提取试剂盒购自Axygen公司，质粒（大量）提取试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自英国OXOID公司，NaCl（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司，购自氨苄青霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 外周血有核细胞分离 采静脉血3 mL于5 mL EDTA抗凝管中，使用红细胞裂解液（0.01 mol／L Tris-HCl pH7.6，0.01mol／L NaCl，0.005 mol／L MgCl2）裂解红细胞，4℃，450 g，离心10 min，收集有核细胞，备用。

1.2.2 总RNA提取 外周血有核细胞、K562细胞（阴性对照）和SK-BR-3细胞（阳性对照）的总RNA均按Trizol试剂盒方法提取。

1.2.3 实时荧光定量RT-PCR （1）RT反应：总体积为10 μL，包括反转录反应液3.5 μL、总RNA溶液5.0 μL、无RNA酶的水1.5 μL。反应条件为：37℃，20 min；95℃，5 min。反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上，备用。（2）标准品的处理：将标准品储存液（2×107拷贝数／μL）梯度稀释为2×106，2×105，2×104，2×103，2×102，2×101拷贝数／μL，备用。（3）荧光定量PCR反应：在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增；反应体系为：模板5.0 μL、PCR反应液15.0 μL、水5.0 μL，其中，模板分别为实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产物、阳性及阴性质控品反转录产物和标准品；反应条件为：37℃，10 min→95℃，15 min→（95℃，15 s→60℃，1 min）。括号内条件共重复45个循环。

图1 BCSG1质粒及其PCR扩增产物电泳图

图2 BCSG1 mRNA实时荧光定量PCR扩增方法的建立

图3 外周血BCSG1 m RNA的定量检测

1.2.4 准确性评价 使用本研究所用试剂和参考试剂同时检测一系列样品来评价试剂的准确性，参考试剂检测的结果作为真实值。准确性用以评价试剂的系统误差，该指标反映样品的检测值和真实值的一致性，以偏差来表示，其计算方法如下：偏差（%）＝（检测值-真实值）／真实值×100。

1.2.5 检测特异性分析 取阳性、阴性质控品及阳性、阴性企业标准品各3份，进行提取细胞总RNA，并进行RT-PCR操作，分析检测结果与实际情况的相符度。

1.2.6 检测灵敏度分析 取正常人抗凝外周血8份（3ml／份），分别加入SK-BR-3细胞各0、1、10、100、1×103、1×104、1×105、1×106个，分离有核细胞、提取细胞总RNA，并进行RT-PCR操作，分析实验结果，确定最低检出限。

1.3 统计学处理 实时荧光定量PCR的结果使用SDS 1.0软件分析，标准曲线使用回归分析处理；定量PCR检测结果用中位数显示，当基因表达水平的检测结果为阴性时，该数据将被视为“0”以方便统计；阳性率比较使用χ2检验。散点图使用ORIGIN 7.5软件绘出并分析。

2 结果

2.1 BCSG1质粒的构建与鉴定 （1）BCSG1质粒的构建：使用Trizol试剂提取SK-BR-3细胞的总RNA，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，总RNA电泳条带呈弥散型分布，28S、18S rRNA条带亮度比值约为2∶1，说明RNA完整性较好；之后进行RTPCR反应，扩增得到166 bp大小的BCSG1基因目的片段；利用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，并与T载体连接、细菌转化、涂板、挑选5个阳性克隆、扩增培养及提取质粒；使用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定质粒，结果如图1所示。

（2）BCSG1质粒的鉴定：将BCSG1质粒进行PCR扩增，产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明各质粒中均含有相应目的DNA片段，产物特异性好（图1）。取3号阳性克隆进行大量培养、提取质粒、稀释10倍后测定260 nm和280 nm吸光值并计算质粒溶液的浓度（copies／μL），使用美国Applied Biosystems公司的377测序仪对提取的质粒进行序列测定。结果表明，质粒中的插入序列与目的片段的理论值完全一致，将上述抽提得到的BCSG1质粒使用TE溶液溶解，并稀释至终浓度为2×107拷贝数／μL，作为定值标准品。

2.2 BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒的建立

2.2.1 实时荧光定量RT-PCR方法的建立 对BCSG1质粒标准品进行倍比稀释、制备标准曲线，建立实时荧光定量PCR方法检测BCSG1 mRNA表达量的方法。结果表明，BCSG1 mRNA定量用标准曲线较为理想，PCR扩增效率为99%（图2A），并且选取具有代表性的外周血标本，对其定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，扩增条带特异性好，产物大小与设计产物大小相同，并且BCSG1在相应标本中的表达亦与理论情况相符，BCSG1 mRNA在乳腺癌癌患者的外周血样品中有表达，而在正常人、乳腺良性疾病患者外周血中均无表达；βactin mRNA在各样品中均有表达（图2B）。综上所述，利用本研究所建立的实时荧光定量RT-PCR方法检测外周血标本中BCSG1及β-actin mRNA的表达量是可行的。

2.2.2 优化BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒组份 （1）阳性、阴性质控品的制备：阳性质控品为含有BCSG1 mRNA的总RNA，阴性质控品为不含BCSG1 mRNA的总RNA，按照Trizol试剂盒方法提取SK-BR-3细胞及K562细胞总RNA，将提取到的总RNA分别用无RNA酶的水溶解至终浓度为0.2 μg／μL，取5 μL RNA样品加入1 ml无水乙醇中，-20℃保存。

（2）试剂盒组成：10人份／盒，每盒中各组分的量为：PCR管（17个）、红细胞裂解液1瓶（20 mL／瓶）、无RNA酶水1瓶（8 mL／瓶）、RNA提取液1瓶（10 mL／瓶）、dNTP混合物1管（6.0 μL／管）、逆转录酶储存液1管（3.0 μL／管）、反转录缓冲液1管（33 μL／管）、PCR反应缓冲液1管（251.75 μL／管）、UNG酶储存液1管（4.75 μL／管）、引物对和探针1管（28.5 μL／管）、标准品1管（10 μL／管）、阳性质控品1管（1.0 μg／管）、阴性质控品1管（1.0 μg／管）。

2.3 BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒性能评价

2.3.1 检测准确性 使用Trizol试剂、Invitrogen公司的M-MLV逆转录试剂，ABI公司的荧光定量PCR试剂作为参考试剂，与本研究所建立的试剂盒一同检测含有BCSG1 mRNA的表达的样品，3次重复试验结果显示，本试剂盒的标准偏差均在±3%之内。

2.3.2 检测特异性 使用本研究所建立的试剂盒对质控品及企业标准品进行检测，三次结果显示，阳性质控品及企业标准品均检测出BCSG1 mRNA的表达，阴性质控品及企业标准品未检测出BCSG1 mRNA的表达，因此，本试剂盒的检测特异度为100%。

2.3.3 检测灵敏度 利用本试剂盒检测含有SKBR-3细胞的样品，灵敏度为＞100copies／mL全血。

2.3.4 稳定性研究 将本试剂盒分别保存于4℃和-20℃，定期测定其准确性、特异性和灵敏度，评价试剂盒的稳定性。结果显示，试剂盒保存在4℃下，1到4个月，其准确性、特异性和灵敏度保持不变，5个月，准确性、特异性和灵敏度下降，6个月试剂盒失效；保存在-20℃环境下，1到12个月，其准确性、特异性和灵敏度保持不变，故保存于-20℃环境中试剂盒有效期至少一年。

2.4 外周血中BCSG1 mRNA的定量检测 利用本试剂盒检测外周血样品，结果表明，12临床已确诊转移的肿瘤患者外周血样品均检测到BCSG1 mRNA的表达，21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性，其余9例为阴性，15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性，未检测到BCSG1 mRNA的表达（图3），临床已确诊转移的肿瘤患者外周血样品中BCSG1 mRNA阳性率及表达量均明显高于未确定转移患者、乳腺良性疾病患者及正常人（P＜0.05）。

3 讨论

目前，乳腺癌的治疗方法有多种，如手术、放疗、化疗及生物治疗等，但高复发和转移率已成为阻碍肿瘤患者生存期提高的主要原因。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，由于自然或侵袭性医源性因素，癌细胞可从原发灶脱落形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，休眠的癌细胞就有可能被激活，从而导致了乳腺癌的复发和转移［1-2］，循环肿瘤细胞的数量与乳腺癌的进展及患者生存期等密切相关［3］。若能及早发现并确定循环肿瘤细胞的存在，将对乳腺癌的诊断、预后和治疗产生重要影响，可以指导临床治疗方案的制定。检测外周血中肿瘤细胞基因及特异性标志物表达是确定肿瘤转移情况的一种有效方法，对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助，但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查，未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力。因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。循环肿瘤细胞中特异性基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过RT-PCR技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在［4-5］。

BCSG1是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其定位于人类染色体10q23，DNA长度约5 kb。BCSG1基因编码合成1条含127个氨基酸的蛋白，其在乳腺癌组织中特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是一种与乳腺癌进展有关的肿瘤标记物［6］。BCSG1基因的表达与肿瘤分期、淋巴结浸润、肿瘤体积及转移等密切相关，在III／IV期乳腺癌中BCSG1的阳性率为71.4%或81%，I／II患者中阳性率为26.8%或15%，BCSG1阳性的乳腺癌患者其生存期较BCSG1阴性患者明显缩短［7-8］。正常人外周血BCSG1 mRNA呈阴性；游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被RNA酶解，故在外周血中若测得BCSG1 mRNA，则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技术。

在本研究中，我们建立和完善了利用实时荧光定量RT-PCR检测BCSG1 mRNA的技术方法及试剂盒（图1，2），优化了试剂盒中的引物、探针；成功制备了定值标准品；通过设立阳性、阴性质控品的方法，解决了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等关键技术问题，并对该试剂盒的准确性、灵敏度、特异性及稳定性等进行了分析评价，结果表明，该试剂盒的特异度及准确性均为95%以上，灵敏度为100拷贝／mL（全血），稳定性较好，在-20℃中保存12个月其性能未发生变化。同时，我们利用该试剂盒对外周血标本中BCSG1 mRNA的表达量进行了检测，结果表明，12例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性，其余9例为阴性；15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性，未检测到BCSG1 mRNA的表达，临床确诊已转移的乳腺癌患者外周血中BCSG1 mRNA表达量和阳性率明显高于未确诊转移的乳腺癌患者、乳腺良性疾病患者及正常人（图3）。由此可推测外周血样品中BCSG1 mRNA的表达量与患者的临床分期等密切相关，是一项较好的血源性乳腺癌细胞的监测指标，可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。利用本研究所建立的试剂盒检测乳腺癌患者血中的BCSG1 mRNA的表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。

（本文图1～3见插图1-2）

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［3］Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，et al.Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breast cancer［J］.N Engl J Med，2004，351（8）：781-791.

［4］Strati A，Markou A，Parisi C，et al.Gene expression profile of circulating tumor cells in breast cancer by RT-qPCR ［J］.BMC Cancer，2011，11：422.

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Establishment and application of a detection kit for human breast cancer-specific gene 1 mRNA by real-time quantitative RT-PCR

CHEN Min*，SHEN Guodong，BIAN Geng，XU Tingjuan，XU Weiping，SHEN Gan，HU Shilian（*Anhui Province Hospital Affiliated Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

HU Shilian，Email：hushilian＠263.net

ObjectiveThis study was to establish a quantitative method for human breast cancer-specific gene 1（Breast cancer-specific Gene 1，BCSG1）mRNA by real-time RT-PCR.Its application was further evaluated by detecting circulation tumor cells in the peripheral blood of breast cancer patients.MethodThe concentration of each component in the detection kit was optimized；the stability，sensitivity and specificity were determined.The expression level of BCSG1 mRNA was detected in the samples of peripheral blood.ResultsOptimized primers and probes were obtained，and setting standards were successfully prepared.Through establishing the positive and negative control materials，the specificity，sensitivity，accuracy and quality control were determined for the detection kit.The specificity and accuracy were both more than 95%，and the sensitivity was of 100 copies／ml（whole peripheral blood）.The detection results of BCSG1 mRNA in peripheral blood samples showed that all the samples were positive for 12 breast cancer patients clinically diagnosed with metastasis；and 12 samples were positive and other 9 samples were negative among 21 breast cancer patients without clinically diagnosed with metastasis or not；all the samples were negative for 15 patients with benign breast disease；and all the samples were negative for 10 healthy control.Conclusion The quantitative RT-PCR assay for BCSG1 mRNA could be used for the detection of circulating tumor cells in peripheral blood of breast cancer patients，which would be valuable for the diagnosis and clinical-decision making for breast cancer patients.

Breast neoplasms；Reagent kits，diagnostic；RNA，messenger；Reverse transcriptase polymerase chain reaction

R446

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.023

2013-04-27）

国家自然科学基金面上项目（81071808）；安徽省国际科技合作项目（10080703037）；安徽省科技攻关项目（12010402126）；安徽省肿瘤免疫营养诊疗产业创新团队资助

程民，助理研究员，Email：chengmin＠ustc.edu.cn

胡世莲，主任医师，教授，博士生导师，Email：hushilian＠263.net