探讨冠状动脉疾病中红细胞氧化应激及流动性的变化

刘海燕

（四川省南充市中心医院心内科，南充 637000）

据世界世界卫生组织（WHO）［1］报告，心血管疾病已经成为全球病死率最高的疾病，并且未来还会继续上升。冠状动脉疾病（CAD）是最常见的心血管疾病之一，其中低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）水平的升高是引起CAD的重要因素之一，同时，氧化低密度脂蛋白（oxyLDL）作为氧化应激的产物参与了动脉粥样硬化和CAD的发生，因此，LDL－C和oxyLDL被认为是CAD疾病的标志物［2］。

亲氧化和抗氧化系统之间的不平衡会引起红细胞结构和功能的损害。研究［3］表明，在CAD患者中发现NADH／NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶（XO）活性增强，从而升高了超氧阴离子自由基的水平，这是最主要的来源。另外，环氧合酶（COX）、脂氧合酶和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）也是血液中的主要来源。虽然般是机体应激情况下才产生（如感染、外界压力刺激等），但当机体出现异常时也会生成。此外，机体内的抗氧化系统提供了天然的防御，以抵御活性氧（ROS）带来的损害。该系统由抗氧化酶如过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽还原酶（GSR）以及小分子的氧化剂，如谷胱甘肽、维生素A、C、E和等离子蛋白质 等 组 成［3，4］。 研 究［4］表 明，红 细 胞 中 SOD 和GPX的活性高于其他的组织细胞，为了防止氧化损伤，抗氧化酶失去氧化还原平衡的活性，CAD疾病中有大量的ROS产生，从而干扰正常的亲氧化和抗氧化间的平衡。本文假设CAD患者ROS的产生会造成红细胞膜结构及功能的紊乱，同时影响抗氧化酶的活性并阻碍其抗氧化功能的发挥，通过评估CAD患者红细胞中氧化还原平衡、细胞膜的流动性及胆固醇水平等可能出现的变化，试图证实CAD患者红细胞氧化应激水平与所选参数间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2012年1月～2013年1月我院治疗的CAD患者20例为观察组，入选标准为40岁以上，不吸烟，且心肌梗死发生6个月以上；选取同期我院体检正常且不吸烟者21例为对照组。观察组中男性16名，女性4名，平均年龄为（63±4）岁，平均收缩压为（119±8）mmHg，平均舒张压为（77±9）mmHg，平均体质量为（86±13）kg，平均BMI为（29.63±4.35）kg／m2，平均血糖水平为（96±9）mg／dL，平均 LDL－C水平为（106±23）mg／dL，平均高敏C－反应蛋白为（2.78±2.76）mg／L。对照组中男性12名，女性9名，平均年龄为（60±3）岁，平均收缩压为（118±3）mmHg，平均舒张压为（72±5）mmHg，平均体质量为（73±6）kg，平均 BMI为（26.34±3.56）kg／m2，平均血糖水平为（82±9）mg／dL，平均 LDL－C水平为（102±18）mg／dL，平均高敏C－反应蛋白为（1.60±1.41）mg／L。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 红细胞的分离 将采集到的末梢血置入含有酸式柠檬酸盐葡萄糖（ACD）溶液（23mmol／L的柠檬酸，45.1mmol／L的柠檬酸钠和45mmol／L的葡萄糖）的试管中，并在4℃下以600r／min的速度离心10min。除去血浆和白细胞后，剩余的红细胞用NaCl溶液洗涤3次，并使最后的血细胞比容为50%。

1.2.2 红细胞膜的分离 采用 Dodge等［5］1963提出的低渗溶血法，将分离后的红细胞悬浮在溶血缓冲液中（20mmol／L的 Tris缓冲液，pH 值7.4，冷却至4℃，在红细胞缓冲液中的体积比为1∶5）。在冰浴中孵育约20min后，样品循环离心（12 000 g，4℃，5min），洗涤（20mmol／L 的 Tris缓冲液，pH值为7.4），直到纯化出红细胞膜。

1.2.3 脂质过氧化作用的测定 采用Stocks和Dormandy［6］1971年提出的方法，将红细胞裂解后加入硫代巴比妥酸（TBA）再测量产物的浓度：将血细胞比容为50%的红细胞悬浮液4℃孵育于20%三氯乙酸和H2O溶液中1h，然后以1 000r／min的速度离心5min，将得到的上清液加入0.26mol／L的TBA，并在100℃条件下加热15min，用λ＝532 nm的波长进行吸光度测定，结果表示为硫代巴比妥酸反应底物（TBARS）浓度，单位为nmol／g。

1.2.4 细胞膜中自由巯基的测定 采用Ellman［7］1959年提出的方法对细胞膜中的SH浓度进行测定：将分离后的红细胞膜溶液用10%SDS稀释，用0.3mol／L的 Na2HPO4和4mmol／L的5，5＇－二硫代双（2－硝基苯甲酸）DTNB室温孵育30min；用λ＝412nm的波长进行吸光度测定，结果表示为巯基的蛋白浓度，单位为μmol／mg。

1.2.5 总 胆 固 醇 的 测 定 采 用 Rodríguez－Vico等［8］1991年提出的用低毒性溶剂提取血脂的方法进行提取：将血脂溶于乙醇和氯仿的混合物中，使用乙酸酐－浓硫酸反应对胆固醇进行测定；用λ＝660 nm的波长进行吸光度测定，结果表示胆固醇的浓度，单位为 mg／mL。

1.2.6 抗氧化酶活性的测定 CAT的活性采用Bartosz［9］2009年提出的分光光度法测定，溶液为1%红细胞悬液，结果表示为CAT的活性，单位为U／mg。GPX的活性同样采用Bartosz［9］2009年提出的分光光度法测定，溶液为红细胞裂解液（从1%红细胞悬液溶血后得到）、谷胱甘肽（GSH）和NADPH的混合液，其结果表示为GPX的活性，单位为U／g。SOD的活性采用 Misra和Fridovich［10］1972年提出的分光光度法测定，溶液为10%的红血细胞悬浮裂解液，结果表示为SOD的活性，单位为U／g。

1.2.7 红细胞膜流动性的测定 采用Shinitzky和Barenholz［11］1978年提出的荧光分光光度计法进行测定，使用Perkin Elmer公司的LS50B荧光分光光度计。1，6－二苯基－1，3，5－三烯（DPH）和［1－（4－三甲铵苯基）－6－苯基－1，3，5－三烯］对－甲苯磺酸（TMADPH）被用于提供相关脂质双分子层的微粘度、第四碳的深度以及下面膜磷脂烷基链的信息。以λ＝348nm作为激发波长，在λ＝426nm处进行读取。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理与分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组红细胞结构功能参数的比较

在红细胞功能结构的对比中，观察组脂质过氧化、红细胞胆固醇及细胞膜的流动性3个指标与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而两组细胞膜中的自由巯基浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1 两组红细胞结构功能参数的比较

2.2 两组抗氧化酶活性的比较

在抗氧化酶活性的比较中，观察组CAT活性和SOD活性与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而两组GPX活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

表2 两组抗氧化酶活性的比较

3 讨论

本研究发现，在冠心病患者中红细胞的功能结构和两类相关抗氧化酶的活性会发生改变，从而给冠心病患者红细胞损伤理论提供了体外研究的证据。这些指标的变化可能是由于冠心病患者自由基和总胆固醇水平升高造成的，而本实验结果显示，ROS水平的升高可引起脂质过氧化。Walter等［12］曾报道，丙二醛（MDA）作为最丰富的羰基脂质过氧化产物之一，是TBARS和心血管疾病的连接纽带，MDA水平的升高意味着发生心血管疾病和心肌梗死的风险较高。

本文研究发现，观察组抗氧化酶活性降低，如CAT和SOD，其主要原因是CAD患者出现了氧化应激反应［13］。自由基的反应可以改变抗氧化酶的活性，如歧化反应产物H2O2对SOD具有抑制作用，因此，SOD需要与其他酶共同作用以脱除H2O2，如 与 CAT 和 GPX 的 合 作［14，15］。如 果 这 些酶的活性下降，SOD的功能将受到威胁。本研究也发现，冠心病患者红细胞的LDL－C和胆固醇水平增加，LDL－C浓度为100mg／dL以上（冠心病患者的LDL－C的浓度应＜70mg／dL）。Karalis［16］研究发现，高LDL－C是CAD的主要危险因素。尽管红细胞胆固醇对CAD的作用存在争议，但许多研究都发现，CAD患者的红细胞胆固醇水平较高。

胆固醇浓度的升高与红细胞膜流动性的变化密切相关，本研究结果显示，红细胞膜中胆固醇的积累导致细胞膜流动性的两个指标TMA－DPH和DPH水平升高。Luneva等［17］也发现，胆固醇的浓度和红细胞膜流动性呈负相关，并可引起脂质过氧化膜的刚性增加。Garcia等［18］研究显示脂质过氧化作用对细胞膜流动性的影响结果显著不同，但大多数研究表明脂质过氧化反应的过程会导致红细胞膜流动性降低。

Sezen等［13］研究发现，氧化应激会导致硫醇基团的氧化。而本研究发现，CAD患者红细胞膜中SH基团的浓度下降，但差异无统计学意义，可能与所选病例数较少有关。

本研究结果表明，CAD患者的红细胞结构功能紊乱，抗氧化系统存在障碍。CAD患者红细胞功能结构紊乱，主要是由于红细胞膜中的胆固醇累积，从而增强了脂质的过氧化作用所致。红细胞膜流动性下降，表明红细胞的结构受到损坏。而CAD患者抗氧化系统中的CAT和SOD活性降低尤其明显。

综上所述，红细胞的结构功能指标及部分抗氧化酶的活性指标可以反应CAD疾病的进程，因而可作为CAD疾病的检查指标。

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