量子点标记链霉亲和素荧光免疫分析金黄葡萄球菌

彭 维, 欧爱芬

(1.广州医科大学，广东广州 510182;2.广州市药品检验所)

(技术方法栏目编辑:张 健)

量子点 (Quantum Dots，QD)，又称半导体纳米晶体，能够接受激发产生荧光，因此，实际上是一种探针[1]。目前，在生物学领域QD应用较多的是Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米微粒[2]。链霉亲和素(streptavidin，SA)又称链霉抗生物素蛋白，具有高度的亲和力，其功能类似亲和素。生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin System，BAS)有以下特征[3]:生物素与亲和素具有高度的特异的亲和性，桥联作用和多级放大作用。在量子点表面标记SA，利用生物素-亲和素系统，将制备得到的CdTe-SA标记物与生物素化的抗体、核酸、受体结合，就可把量子点标记到细胞、核酸、蛋白质上，进行示踪检测和功能研究。本研究以量子点标记的链霉亲和素为标记试剂，将生物素-亲和素系统应用于荧光免疫分析中，建立了一种快速测定金黄葡萄球菌的分析方法。

1 实验方法和步骤

1.1 长臂生物素的活化 生物素的分子量较小，预先活化后，可使生物素噻吩环的戊酸侧链上的羧基与抗体、酶等生物大分子以酰胺键偶联。由于生物素与抗体或酶结合后极易受到大分子蛋白空间位阻效应(sterichindrance)的影响，使用长臂生物素可以减少位阻效应，提高实验的灵敏度[4]。长臂生物素是在生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加2分子6-氨基己糖，活化生物素的制备是获得高敏感度BAS制剂的关键环节。长臂活化生物素(BCNHS)的制备过程分为两步:先制成生物素，再合成长臂生物并使其活化。

1.1.1 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS)的制备:⑴取生物素1g混悬于12ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌均匀，分别加入0.6g N-羟基丁二酰亚胺(HOSU)和0.8g二环己基碳二亚胺(DCC);⑵将上述溶液置于密闭容器内，锡纸包装避光，室温下磁力搅拌过夜;⑶0.45μm滤纸过滤，取滤液保存静止30min;⑷滤液通过旋转蒸发仪蒸干，加10ml乙醚洗涤瓶底;⑸继续加200ml异丙醇使其重结晶，获得的白色粉末状晶体，既是BNHS。

1.1.2 长臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制备:⑴称取BNHS 341mg,6-氨基己糖盐酸盐200mg，溶解于5ml DMF，搅拌均匀;⑵加入0.152ml三乙胺(TEA)，室温搅拌下作用20h;⑶旋转蒸发仪蒸发去除DMF，加lmmol/L NaOH 3ml，继加甲醇至溶液变清，匀速搅拌2h。蒸发去甲醇，加10ml蒸馏水，搅拌下滴加浓盐酸酸化至刚果红指示剂恰好变色;⑷室温静置2h后，入4℃冰箱过夜保存;⑸收集白色固体物，干燥后用水重结晶，再经真空干燥，所得物即为长臂生物素。

1.1.3 长臂生物素的活化:称取长臂生物素357mg溶于10ml DMF中，加130mg HOSU和适量缩合剂，室温搅拌下作用48h。滤纸过滤，收集滤液蒸发完全，加乙醚洗涤后，用10-15ml无水异丙醇重结晶，所得粉末状固体即为活化长臂生物素。

1.2 长臂生物素结合物的制备 ⑴无水二甲亚砜(DMSO)配制l0mg/ml长臂生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。⑵硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)配制浓度为1mg/ml的金黄葡萄球菌IgY抗体溶液。⑶按4:1的比例将生物素酯加入金黄葡萄球菌IgY抗体溶液中，混合均匀并在室温下孵育4h。在结合反应完成之前DMSO的终浓度不能低于5%，否则生物素酯会出现沉淀。⑷将生物素结合金黄葡萄球菌IgY抗体溶液用PBS缓冲液透析，以除去未结合的生物素。由于生物素分子较大，故透析时间尽量较长，以纯化生物素化抗体溶液。

1.3 生物素化抗体的紫外分光检测 将1.2项制备好的生物素化抗体溶液，通过紫外分光光度计全波长扫描测定制备的生物素化抗体的最大吸收峰值，同时比较金黄葡萄球菌IgY抗体的紫外扫描图片。

1.4 生物素化抗体的凝胶电泳鉴定 使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)对生物素化抗体的纯度进行鉴定。

1.5 量子点标记链霉亲和素的透视电镜检测 取少许的量子点标记链霉亲和素溶液，透射电镜扫描，观察量子点标记链霉亲和素的制备效果。

1.6 量子点标记链霉亲和素的荧光光谱检测 取少许量子点标记链霉亲和素溶液，荧光光谱扫描测定，观察量子点标记链霉亲和素发射光谱及最大吸收峰。

1.7 量子点标记链霉亲和素免疫检测方法的建立 ⑴取金黄葡萄球菌抗原用PBS缓冲液稀释至108cfu/ml，包被96孔板，每孔加100μl 的金黄色葡萄球菌抗原，4℃过夜;⑵倾去包被液，PBST洗涤三次，每次在吸水纸上拍干，每孔加入150μl 5%的脱脂牛奶(溶于PBST)，37℃封闭孵育40min;⑶倾去封闭液，PBST满孔洗涤三次，每次在吸水纸上拍干;⑷每孔依次加入100μl不同浓度的金黄葡萄球菌溶 液(1×l010cfu/ml，1×l09cfu/ml，1×l08cfu/ml，1×l07cfu/ml，1×l06cfu/ml，1×l05cfu/ml，1×l04cfu/ml，1×l03cfu/ml)和100μl生物素化金黄葡萄球菌IgY抗体溶液，震荡均匀后，37℃孵育1h;⑸PBST洗涤 3 次，每次在吸水纸上拍干;(6)每孔加入100μl QDs-SA复合物溶液，37℃孵育40min，洗涤3次并甩干，使用酶标仪测定荧光信号强度(激发波长和发射波长分别为350nm、485nm)，利用标准曲线法确定样品中金黄葡萄球菌的含量，每次平行测定三组数据取平均值。

2 结果与分析

2.1 生物素化抗体的紫外分光检测结果 金黄葡萄球菌IgY抗体溶液的吸收峰在280nm处发生了位移，表明生物素成功标记到了金黄葡萄球菌IgY抗体上(图1)。

图1 生物素化抗体和金黄葡萄球菌IgY抗体溶液的紫外可见光谱图

2.2 生物素化抗体凝胶电泳鉴定结果 生物素标记金黄色葡萄球菌IgY抗体SDS-PAGE电泳结果见图2:金黄色葡萄球菌IgY在22.0-30.0kDa和67.0-70.0kDa相对分子质量处有两条清晰的蛋白带，分别为IgY的轻链和重链，标记后显示生物素化抗体分子量略高于IgY抗体，初步表明标记成功。

2.3 量子点标记链霉亲和素的透视电镜检测结果 偶联链霉亲和素的CdS量子点仍以单分散形式存在，形态均匀、呈球形，量子点之间没有发生团聚，分散性较好，粒径大小约为8-10nm，较CdS量子点稍大。

2.4 量子点标记链霉亲和素的荧光光谱检测结果 用于免疫荧光探针的QDs-SA的激发光谱较宽且连续分布，在350nm激发光下的荧光发射光谱较窄，荧光强度较大，最大发射峰在485nm处。

图2 SDS-PAGE凝胶电泳结果

2.5 量子点标记链霉亲和素免疫检测方法的建立 量子点标记链霉亲和素免疫检测方法测定结果显示在1×l010cfu/ml-1×l04cfu/ml浓度范围内有良好的线性相关，线性回归方程为y=1.6786x－1.7786，相关系数为R2=0.9942，根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的建议，通过计算得到对金黄色葡萄球菌检出限浓度为2.7×104cfu/ml。通过对1×l010cfu/ml和1×l04cfu/ml的金黄葡萄球菌进行8次平行测定，其相对标准偏差均小于5%，量子点标记检测方法显色后24h之内其荧光信号变化较小，稳定性高。

3 小结

本实验通过建立量子点标记链霉亲和素免疫检测金黄葡萄球菌方法，结果显示金黄葡萄球菌的浓度在1×l010cfu/ml-1×l04cfu/ml浓度范围内，相对荧光强度有良好的线性相关，其检出限浓度为2.7×104cfu/ml，量子点标记检测方法显色后24h之内其荧光信号变化较小，稳定性高，为检测金黄葡萄球菌提供新的有效方法。

[1]邵君，尤晓刚，高峰，等.量子点标记链霉亲和素及其生物活性检测[J].分析化学，2006,34(11):1625-1628.

[2]任国兰,柴宜民,韩素琴,等.II-VI型量子点在分析中的应用[J].山西师范大学学报(自然科学版),2003,17(03):39-43.

[3]Kui Jiao,Shushen Zhang.Technology of immunoassay of ELISA and its application[M].Beijing,Chemical Industry Press,2004.94.

[4]钱建瑞,赵艳伟,梁艳,等.量子点标记链霉亲和素荧光免疫分析测定雌三醇[J].分析试验室，2009，28(6):104-106.