三七细菌性叶斑病病原菌鉴定

张照然　禹虹霞　马彦娇等

摘要 [目的]对引起三七细菌性叶斑病的病原菌进行系统鉴定。[方法]以2011及2012年在云南文山及石林縣的三七苗圃采集的三七细菌性叶斑病病株为材料，采用柯赫氏法则，检测分离菌株致病性并重新分离得到病原菌。通过病菌形态观察、致病性测定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析（Biolog系统）对其进行鉴定。[结果]确定三七细菌性叶斑病病原菌为丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）。[结论]该研究为三七细菌性叶斑病菌详细鉴定的国内首报。

关键词 三七细菌性叶斑病；丁香假单胞菌；病原菌鉴定

中图分类号 S435.67 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）05-01351-02

Abstract [Objective] To identify bacterial leaf spot disease caused by Pseudomonas syringae pv. syningae on Panax notoginsng. [Method] The tested materials were collected from Wenshan and Shilin County in Yunnan Province in 2011 and 2012， using Kochs rule， through morphology observation， pathogenicity test， 16S rDNA sequence analysis and biochemical and physiological characters， the identification was conducted. [Result] The pathogen was identified as Pseudomonas syringae pv. syringae according to the characters of cultural colonies， morphological observation， 16S rDNA sequences analysis and biochemical and physiological identification （Biolog carbon source utilization analysis）. [Conclusion] This was the first report of Pseudomonas syringae pv. syringae caused bacterial leaf spot of Panax notoginsng in China.

Key words Panax notoginsng； Pseudomonas syringae pv. syringae； Pathogens identification

三七（Panax notoginsng （Burk）F.H Chen）是我国的名贵中药材，主产地为云南省文山县，但长达3年的生长周期，使三七遭受了各类病虫害的侵染。目前文山三七主产区主要病害有软腐病、圆斑病、细菌性青枯病、疫霉病、灰霉病[1-2]、根结线虫病[3]等。2011年8月及2012年7月，笔者先后在云南省文山县和石林县的三七种植片区发现了一种新的叶片病害——三七细菌性叶斑病暴发，且影响程度越来越严重，大有蔓延流行的趋势。这种病害在初期虽然只引起叶斑症状，但后期可引起叶片局部枯萎坏死和整株死亡。目前国内并无关于三七细菌性叶斑病详细鉴定的相关研究。为此，笔者从形态鉴定、致病性测定、16S rDNA序列分析及生理生化特性分析对引起三七细菌性叶斑病的病原菌进行了系统鉴定，以期为提高三七的品质、产量及病害防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为SQYB12（云南文山）和SQYB13（云南石林）；供试三七植株采自云南省文山县和石林县的三七种植区；供试培养基、试剂及仪器参照周丽洪等人研究[4]。

1.2 方法

1.2.1

标样采集。2011年8月与2012年7月分别从云南省文山县和石林县的三七种植基地采集具典型细菌性叶斑病症状的三七标本。

1.2.2

分离培养及形态鉴定。

采用平板划线分离，具体操作参照王敏等人研究[5]。纯化保存方法参照白学慧等人研究[6]。两次分离共获得8株细菌菌株，编号分别为SQYB11、SQYB12、SQYB13、SQYB14、SQYB15、SQYB16、SQYB17、SQYB18。该试验采用的菌株为SQYB12及SQYB13。病原菌形态鉴定方法参照王永吉等人研究[7]。

1.2.3

致病性测定。致病性测定采用喷雾接种法接种，具体步骤参照姬广海等人研究[8]。对照三七喷雾接种无菌水。待症状出现后，采集病斑重新分离。

1.2.4

生理生化鉴定。

生理生化测定试验采用Biolog公司的MicrostationTM V4.01系统和革兰氏阴性菌微孔板（GN）来鉴定，具体鉴定方法参照吴亚鹏等的报道[9-11]。

1.2.5

16S rDNA序列同源性分析。细菌的基因组DNA提取采取细菌快速微量提取法进行[12]，然后利用琼脂糖电泳检测提取DNA浓度和纯度。16S rDNA的通用引物27F/1492R对SQYB12和SQYB13进行PCR扩增。PCR扩增体系及程序参照刘娜等人研究[13]。PCR扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳分离，检测扩增后的目的条带。用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒，对SQYB12和SQYB13的PCR产物进行纯化克隆（试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，纯化克隆步骤均参照试剂盒）。将克隆后的大肠杆菌菌液送去测序公司测序。测序后将目的片段剪切下来，然后同时采用GenBank Blast以及DNAMAN进行序列同源性比较[14]。

2 结果与分析

2.1 病害症状观察及致病性测定

健康三七噴雾接种SQYB12和SQYB13 15 d后，三七叶片有轻微的发病症状，开始出现淡绿色水渍小点。21 d后，叶片上的小斑点开始聚集成棕色不规则大病斑，病斑直径3～10 mm，周围出现黄色退绿晕圈。30 d后，不规则大片病斑逐渐变褐，形成枯斑（图1）。40 d 后三七叶片开始失水萎蔫，甚至枯萎落叶。对照三七植物上始终未观测到发病症状。

经观察，喷雾接种后各时期发病症状均与三七细菌性叶斑病自然发病症状相似。叶斑初期常见于叶缘，常引起叶片退绿并形成褐色病斑。湿度高时，发病情况加重且侵染速度加速。发病后再分离出的3株菌株分别命名为SQYB21、SQYB22、SQYB23。

3 结论与讨论

综合病害症状观察和病菌分离、病菌形态观察、病菌Biolog生理生化测定、16S rDNA序列分析等鉴定方法，可将引起三七细菌性叶斑病病原菌鉴定为丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）[17-19]。该病害症状为发病初期叶片边缘出现不规则病斑，病斑周围有退绿黄色晕圈，发病严重时可引起全株枯萎。高温高湿环境下，病害扩展迅速，可在短期内造成三七成片死亡。

从Biolog微生物鉴定系统显示结果，以明确试验菌株与数据库中标准菌株对各类碳氮源利用率的差异。标准菌株部分利用，但试验菌株可完全利用的碳源有乳果糖（B9）、D甘露醇（B11）；试验菌株部分利用，但标准菌株可完全利用的碳源有α-酮戊二酸（E4）、γ-氨基丁酸（G12）；试验菌株可部分利用，但标准菌株不能利用的碳源有L-亮氨酸（G3）、龙胆二糖（B5）。虽然了解了试验菌株与标准菌株对各类碳氮源利用率的差异，

但是造成这种差异的原因目前还不明确，笔者猜测是由于细菌的进化和分化所造成的。另外，笔者将收集多个地区的三七细菌性叶斑病病原菌，对其致病力、生化型及致病型[20]进行研究，以了解病菌的多样性，同时利用repPCR分子指纹技术[21] 对病菌遗传多样性进行分析。目前三七叶斑病菌的拮抗细菌菌株的筛选[19]试验工作已经开展，期望能达到预防和控制三七细菌性叶斑病利于三七产业的效果。

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