补肾填精含药血清对成骨细胞增殖分化及碱性磷酸酶活性检测的研究

郭彦涛 杨少锋 邓博

摘要：目的：探讨金刚健骨片对成骨细胞增殖分化及堿性磷酸酶表达的影响,为补肾填精药物治疗骨质疏松提供可靠的实验依据。方法：采用中药血清药理学方法制备补肾填精中药含药大鼠血清；用多次酶消化法体外培养成骨细胞；将不同实验组补肾填精中药含药血清分别加入新生大鼠成骨细胞培养液中, 研究它们对成骨细胞增殖与分化成熟的影响；细胞增殖采用MTT法进行分析; 细胞分化并于培养第5天检测碱性磷酸酶活性(组织化学法)。结果：①P0 代细胞接种培养至12 h 左右贴壁,24 h 后数量明显增加,体积开始增大, 3d 后细胞开始交联融合;②细胞培养1d、2d、3d检测，实验组与对照组成骨细胞增值率差异显著（P<0.05），组间比较金刚健骨片组较福善美组、骨松宝组差异明显（P<0.05）；③电镜下观察成骨细胞碱性磷酸酶染色阳性率，可见实验组较对照组明显；组间比较，金刚健骨片组阳性率最为显著。结论：补肾填精中药及西药对照组含药血清均可促进成骨细胞的增殖、分化，提高成骨细胞的活性，金刚健骨片作用最为明显。

关键词：补肾填精；细胞培养；成骨细胞；碱性磷酸酶；增殖；分化

Abstract:: Objective: To investigate the effect of osteoporosis on proliferation and differentiation of osteoblasts and alkaline phosphatase expression, to provide experimental evidence for treating osteoporosis drugs for nourishing kidney-essence.Methods: the serum pharmacology of traditional Chinese medicine preparation method of Tonifying the kidney essence of medicated serum of rats with multiple enzyme digestion; osteoblasts in vitro; the kidney in different experimental groups were added to fill the refined pastille serum of newborn rats osteoblasts in culture medium, to study their effects on osteoblast proliferation and differentiation; cell proliferation was determined by MTT analysis; cell differentiation and cultured for fifth days in the alkaline phosphatase activity test (histochemical method).Results: P0 cells were cultured for 12 h or 24 h after adherent, significantly increased the number, volume began to increase after 3D, cells begin to cross fusion; 1D, 2D, 3D detection of cell culture, differences between the experimental group and the control of osteoblast growth rate significantly (P<0.05), comparisons between groups Jingang Jiangu slice group than Fosamax group, Gusongbao group significantly (P<0.05); ③ electron microscope into bone cells alkaline phosphatase staining positive rate, showed the experimental group than in the control group significantly; comparison between groups, osteoporosis group positive rate is the most significant.Conclusion: Bushen Chinese medicine and Western medicine control group containing serum can stimulate the proliferation, differentiation of bone cells, improve the activity of osteoblasts, Jingang Jiangu tablet for the most obvious role.

Keywords: Bushen Tianjing; cell culture; osteoblast; alkaline phosphatase; proliferation; differentiation

【中图分类号】R969 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602(2014)05-0009-02

骨质疏松症是一种以骨量减少，骨组织显微结构退化为特征，以致骨的脆性增高而骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病[1]。近20 年来， 国内广泛开展了中医中药及中西医结合防治骨质疏松症的研究， 中医药治疗骨质疏松症的疗效已经得到一定范围的学术认同，并引起较广泛重视[2]。中医学认为"肾虚髓亏"是骨质疏松发病的核心中医病理本质[3]。补肾填精法是中医药治疗骨质疏松症的核心治法之一。金刚健骨片作为补肾填精法的代表方，在临床中应用较广，前期研究已证实其较好的临床作用及其对骨质疏松症相关基因的正向作用[4]。本实验拟通过应用不同组别的补肾填精含药血清对体外培养的成骨细胞进行干预，观察其对成骨细胞增殖、分化的影响，探讨补肾填精法治疗骨质疏松症的作用机制。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物:

新生24h内SD大鼠5只，SPF级，购于湖南中医药大学实验动物中心，用于成骨细胞的体外分离及培养；成年SD大鼠（300g±20g）40只，雌雄各半，购于湖南中医药大学实验动物中心，用于制备含药血清。

1.2 主要仪器、试剂:

①胎牛血清（FBS）（GIBCO，美国）；②MEM培养基（GIBCO，美国）；③I型胶原蛋白酶（Sigma，美国）；④0.25%胰蛋白酶（GIBCO，美国）；⑤茜素红S（Sigma，美国）；⑥Cell Counting Kit-8试剂盒(CCK-8)（同仁化学，日本）；⑦实验室常用化学试剂（国药集团，中国）；⑧DEPC（Sigma，美国）；⑨StepOnePlusTM RT-PCR系统（ABI公司，美国）；⑩PCR仪（Bio-Rad，美国），逆转录试剂盒及PCR试剂盒（TaKaRa，日本）。

1.3 药物及含药血清制备:

①福善美，杭州默沙东制药有限公司生产，用量：70mg/片，每周一片，生产批号：120511；②金刚健骨片，由补骨脂、熟地黄、川牛膝、鹿角胶、菟丝子、肉苁蓉、杜仲、粉萆、山药组成，购自湖南中医药大学附属第一医院药剂科，用量：0.3g/片，一次10片，一日3次，生产批号：20120924；③骨松宝，由淫羊藿、赤芍、三棱、莪术等组成，贵州富华药业有限责任公司生产，用量，0.5g/粒，一次2粒，一日3次，生产批号：20120503；④生理盐水购自国药集团。

以上药物按照人与大鼠剂量换算公式折算为大鼠每天的等效剂量，连续灌胃2次，间隔2次，于末次给药1h后，以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后经腹主动脉采取全血，室温静置2小时后以1500rpm离心20min，吸出上层血清，一次性滤器抽滤除菌，56℃灭活30min后分装待用，保存于-80℃冰箱。

1.4 成骨细胞的体外提取及培养:

取新生24h内SD大鼠5只，浸没于75%酒精10min，脱颈处死后在无菌条件下分离大鼠颅盖骨；PBS反复清洗以清除骨片表面附着的血管、粘膜等结缔组织；以眼科剪将骨组织剪碎，碎片约1mm3；以5ml 0.25%胰蛋白酶将骨片消化20min；弃胰蛋白酶消化液，加入5ml 0.1%I型胶原蛋白酶37℃恒温气浴震荡消化45min，收集上清液，转移至新的离心管，1000r/min离心5min；将剩余骨片在0.1%I型胶原蛋白酶中重复消化2次，1000r/min离心5min；将三次所得细胞以MEM培养液（含15%FBS）反复吹打混匀，制成细胞悬液，以105/ml的密度接种于25cm2培养瓶中，置于5%CO2培养箱中37℃培养；每天于倒置显微镜下观察细胞生长状态，隔天换液一次。当细胞生长至汇合时，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:3传代培养，第三代细胞用于后续实验。

1.5 实验分组及干预方案:

本研究共分四组：①福善美组（10%福善美含药血清+MEM培养基+双抗）②金刚健骨片组（10%金刚健骨片含药血清+MEM培养基+双抗）③骨松宝组（10%骨松宝含药血清+MEM培养基+双抗）④对照组（10%生理盐水含药血清+MEM培养基+双抗）

1.6 成骨细胞增值率的检测:

取第三代成骨细胞，以每孔5000个细胞的密度接种于96孔板，每组各设置6个复孔，24h后弃上清，加入含各组相应药物的培养液，分别于加药干预培养1d、2d及3d时取出孔板，弃培养液，各孔加入10% CCK-8试剂，37℃孵育2h，于450nm处测定各孔的吸光度值。

1.7 成骨细胞碱性磷酸酶染色:

第三代细胞以105/ml的密度接种于六孔板，细胞贴壁后更换为含各组药物的培养液干预培养5d，隔天换液一次，收取培养板时，弃培养液，以中性福尔马林固定细胞5min，PBS清洗两次，将NBT/BCIP染色液覆盖细胞表面，避光染色1h，PBS清洗两次后置于光镜下观察。

1.8 统计学方法: 所有实验采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±S）形式表示，P<0.05则认为数据间的差异具有统计学意义；各组组间比较采用One-way ANOVA。

2 结果

2.1 成骨细胞形态学观察:

图1光镜下的成骨细胞（×100）

图1注：A：原代成骨细胞培养24h（×100）；B：原代成骨细胞培养3d（×100）

图1可见： P0 代细胞接种培养至8 ～12 h 左右贴壁， 形态呈三角形、纺锤形或多角形等( 图1A)， 24 h 后数量明显增加， 体积开始增大， 3d 后细胞开始交联融合 ( 图1B)。 图片显示补肾填精中药及西药对照组含药血清均可可明显促进成骨细胞的分化。

2.2 成骨细胞增殖检测:

表1 成骨细胞增殖率检测

组别 N 1d 2d 3d

福善美组 6 1.249±0.024①② 1.803±0.045① 2.308±0.054①

金刚健骨片组 6 1.185±0.009①②③ 1.931±0.056①②③ 2.607±0.061①②③

骨松宝组 6 1.126±0.032① 1.778±0.048① 2.343±0.095①

对照组 6 1.065±0.019 1.504±0.044 1.992±0.024

注：①与对照组比较，P<0.05；②与骨松宝组比较，P<0.05；③与福善美组比较，P<0.05；

表1显示：培养1d检测，实验诸组与对照组细胞增殖率有统计学差异（P<0.05），以西药对照组福善美组最为明显；细胞培养2d、3d检测，实验组与对照组差异较前显著（P<0.05），组间比较金刚健骨片组成骨细胞增值率较福善美组、骨松宝组差异明显（P<0.05）。结果表明：补肾填精及西药含药血清对成骨细胞的增殖均有明显促进作用，初期以福善美组明显，随培养时间推移，金刚健骨片组对成骨细胞的促进作用增强，其正向作用强于西药对照组。

2.3 成骨细胞碱性磷酸酶染色：

圖2 成骨细胞碱性磷酸酶染色

图2注：A：福善美组；B：金刚健骨片组；C：骨松宝组；D：对照组

图2可见：含药培养液干预培养5d后电镜下观察染色阳性率，可见A组福善美组、B组金刚健骨片组及C组骨松宝组其成骨细胞的活性较对照组D组明显；实验组间比较， B组金刚健骨片组阳性率最为明显，福善美组次之，骨松宝组较差。图2表明：实验各组（A/B/C）均可提高成骨细胞的活性，金刚健骨片组效果最强。

3 讨论

骨质疏松症属于祖国医学"骨痿"范畴。 "肾虚髓亏"是骨质疏松发病的核心中医病理本质，补肾填精法是中医药治疗骨质疏松症的重要治法。金刚健骨片在古方"金刚丸"的基础上化裁而成，是补肾填精中药的代表方之一，全方由补骨脂、熟地黄、川牛膝、鹿角胶、菟丝子、肉苁蓉、杜仲、粉萆、山药组成，其中以熟地黄、鹿角胶为君药补肾生髓；补骨脂、肉苁蓉、杜仲、菟丝子为臣，补肾益精，强筋健骨；配以川牛膝、粉萆、山药祛风除痹、引药下行。具有补肾益髓，健骨强筋的功效。前期的临床研究证明其对于老年或妇女绝经后骨质疏松症有着较好的临疗效[4]，但其作用机制及途径尚待探讨。

成骨细胞是骨形成的主要功能单位， 刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟是防治骨质疏松症的主要方法。体外培养成骨细胞是药效评价和新药开发的重要研究手段[5]。体外培养和实验用的成骨细胞均经过细胞增殖、细胞外基质成熟和基质矿化3个阶段[6]， 与体内发育有相似之处， 其在骨重建过程中发挥重要作用，用离体成骨细胞培养可观察到药物的直接作用，可作为抗骨质疏松药物筛选的重要途径。本实验研究发现：通过不同时段成骨细胞形态学的观察以及成骨细胞增值率的检测，补肾填精中药及西药对照组均可对对成骨细胞增殖率有明显影响，可促成骨细胞的分化的作用，从而促进骨形成，其中金刚健骨片的作用强于中药与西药对照组；其成骨细胞增值率的检测变化与培养时间有一定的相关性，早期以西药对照组作用明显，其后随培养时间推移，金刚健骨片作用更为明显。

ALP活性是成骨细胞功能及分化程度的重要指标， 其活性的高低可反映成骨细胞的成熟状态，ALP活性越高，表明细胞越趋成熟，而ALP活性降低，则说明细胞趋于增殖状态[7]

。 因此， 测定细胞内ALP活性，能反映某一影响因素的效应。本研究证实：补肾填精中药及西药对照组对成骨细胞的代谢均有一定的效应，电镜下大体观察，金刚健骨片组对成骨细胞碱性磷酸酶染色的阳性率最为明显。

本研究通过补肾填精

含药血清对体外培养的成骨细胞进行干预， 观察对其增殖和分化的影响， 从而探讨补肾填精药物促进成骨细胞增殖、分化及其防治骨质疏松的可能机制。实验表明：以金刚健骨片为代表的补肾填精中药含药血清能促进成骨细胞的增殖、提高细胞内ALP活性，这可能是其防治骨质疏松的细胞学机制之一，为补肾填精法治疗骨质疏松症的进一步研究提供实验依据。

参考文献

[1] 王吉耀主编, 内 科 学(上下 册)[M], 第2版，北京.人民卫生出版社，2010.8:1078.

[2] 中国健康促进基金会骨质疏松防治中国白皮书编委会．骨质疏松症中国白皮书．中华健康管理学杂志．2009，3(3)：148-154．

[3] 刘新辉,杨少锋,何东等，腰椎退行性骨关节炎患者伴发I型骨质疏松流行病学研究，中国中医骨伤科杂志，2009年5月第17卷第5期：64-65.

[4] 杨少锋，李玲慧，陈青等，金刚健骨片调节整合素β１和avβ3表达水平的实验研究，中国骨伤，2013年第26卷第2期：48-51.

[5] 楊国安,吴涤，骨质疏松候选基因的研究进展，包头医学院学报，2012年第28卷第5期:121-122.

[6] Magerstenfeldlc，Owente. Factoes that promotepro- gressive developmentofthe osteoblaet phenotypein cultured fetal rat calvariacells[J]. J Cell Physiol, 1990, 143(2): 213-221.

[7] Ssutta，Bertramp， Brautigrnm. The role of glu-cocorticoids and prostaglandin E2in the recruitment of bone mar-row mesenchymal cells to the osteoblastic lineage: positive and

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