应用生物反应器培养ST细胞制备猪传染性胃肠炎病毒

何锡忠　李春华　潘洁　张婉华　彭丽英　倪建平　张春玲　蒋凤英　徐伟林

摘 要：通过生物反应器制备猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），研究了感染复数（MOI）、微载体浓度、病毒感染时间（TOI）和病毒维持液对病毒效价的影响，结果表明，分别以1：500稀释种毒（8.0 LgTCID50/mL）后接种、接种72 h的ST细胞、5 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+0.2 %水解乳蛋白（LH）的参数培养方式效果最为理想。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒；参数；ST细胞；生物反应器

中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）06-0048-03

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV）是猪的一种高度接触传染性肠道疾病，以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率（通常100 %）为特征[1]。目前，国内一般采用克氏瓶或转瓶培养ST细胞生产猪传染性胃肠炎（TGE）疫苗，存在劳动强度大、病毒毒价低和疫苗质量不稳定等缺点。应用生物反应器系统和微载体培养贴壁细胞具有高比表面积、细胞产量高，便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点。生物反应器培养细胞繁殖狂犬病病毒，病毒最大滴度能达到1.38×108 pfu/mL[2，3]，应用激流式生物反应器可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产[4]，且生产的疫苗质量达到WHO要求。为此，本文对生物反应器系统和微载体培养ST细胞制备猪传染性胃肠炎病毒进行研究，以探讨利用生物反应器培養ST细胞生产猪传染性胃肠炎病毒的技术可行性，为进一步优化培养过程和大规模工业化生产疫苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和培养基

猪睾丸（ST）细胞由上海市农业科学院畜牧兽医研究所研发中心提供；培养基为含100 mL/L新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（GIBCO公司）；病毒繁殖培养基为含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM（LG-DMEM）、MEM和高糖DMEM（HG-DMEM）。

1.1.2 病毒

TGEV由上海市农业科学院畜牧兽医研究所研发中心分离、鉴定和保存。

1.1.3 微载体（Cytodex TM 3）

购自Amersham pharmacia Biotch AB公司；CT-3微载体，经无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液浸泡，121 ℃高压灭菌30 min，再浸泡在含100 mL/L新生牛血清的DMEM的培养基中，置37 ℃、50 mL/L CO2培养箱过夜，待用。

1.1.4 生物反应器

1.5L CelliGen生物反应器（New Brunswick Scientific Co. LTD USA公司），工作体积1.2 L，溶氧（DO）和pH由压缩Air、O2、N2和CO2 4种气体控制，笼式搅拌桨由磁力驱动器驱动。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

适量T-50方瓶ST细胞，长满单层时，先用含 0.2 g/L EDTA的PBS液清洗3次，再加入含2.5 g/L胰酶消化片刻，倾去胰酶，加含100 mL/L新生牛血清的DMEM培养基，吹打备用。安装好反应器和管路后，分别用pH值为4.00和6.86的标准pH溶液在25 ℃下标定pH 电极。在罐内加入PBS液，121 ℃高压灭菌。冷却后安装到反应器控制系统上，连接好压缩Air、O2、N2和CO2 4种气体管线，校正DO电极后，将罐内PBS液压出，工作体积为1.2 L，加入不同浓度的微载体和细胞 于1.5 L生物反应器中，控制DO为40 %空气饱和度，搅拌速度为55 r/min，温度为37 ℃，pH值为7.2，进行培养。

1.2.2 TGEV病毒培养参数的优化

TGEV在不同参数下的病毒效价情况进行优化比较。

在感染时间（TOI）为72 h细胞、微载体浓度为 5 mg/mL、接种细胞密度为2.64×105 个/mL和维持液含 2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM条件下，比较不同感染复数（MOI）[1：100、1：500和1：5 000稀释的病毒原液（8.0 LgTCID50/mL）]对TGEV增殖的影响。

TOI为72 h细胞、接种细胞密度为2.64×105 个/mL、MOI以1：500稀释的病毒液和维持液含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM条件下，比较不同微载体浓度 （3 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL）对TGEV增殖的影响。

接种细胞密度为2.64×105个/mL、在微载体浓度 为5 mg/mL、MOI以1：500稀释的病毒液和维持液含2 g/L水解乳蛋白（LH）的低糖DMEM条件下，比较不同TOI（48、72和96 h）对TGEV增殖的影响。

在微载体浓度为5 mg/mL、MOI以1：500稀释的病毒液、TOI为72 h细胞，比较不同病毒维持液（MEM、HG-DMEM和LG-DMEM）对TGEV增殖的影响。

1.2.3 TGEV病毒TCID50的测定

采用96孔板测定TCID50，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

2 结果

2.1 MOI对TGEV增殖的影响

病毒100和500倍稀释后接种ST细胞病毒效价均为11.5LgTCID50/mL，而病毒5 000倍稀释后接种产生的病毒效价仅为9.0LgTCID50/mL（表1），可见MOI较高时，24 h时间内微载体上几乎所有细胞被病毒粒子感染，病毒效价的峰值出现得早且高；MOI较低时，病毒效价的峰值出现得晚且低。

2.2 微载体浓度对TGEV增殖的影响

不同微载体浓度对TGEV增殖影响的试验结果见 表2。从理论上讲微载体浓度越高细胞密度越大，繁殖TGEV的介质就越多，TGEV的效价就越高。但5 mg/mL和10 mg/mL微载体濃度所对应TGEV效价无显著影响。 3 mg/mL微载体浓度时TGEV效价略低为9.0 LgTCID50/mL。

2.3 TOI对TGEV病毒增殖的影响

由上表3可知，分别在细胞培养后第48、72 和96 h接种病毒，其所对应的最高病毒滴度分别为10.5、11.5和9.0 LgTCID50/mL。这可能是与细胞的生理状态有关，由于TGEV的病毒复制较快且容易失活，尽可能确保细胞同步感染和病毒同步复制，使单位细胞产量在较短时间内达到最高。

2.4 维持液体对TGEV病毒增殖的影响

培养基的营养成分对TGEV病毒增殖的影响见表4。在各种培养基中，以DMEM为病毒维持液的病毒效价较高；低糖DMEM添加20 mL/L小牛血清后作为维持液产生的病毒效价略低，而添加2 g/L水解乳蛋白产生的病毒效价最高，为11.0 LgTCID50/mL。

3 讨论

3.1 MOI大小决定着每个宿主细胞被病毒感染的机会，直接影响着细胞失活速率或接毒后细胞的生长情况，同时也决定着病毒对细胞的感染方式[5]。MOI较高时，每个细胞被病毒感染的机会高，且以同步感染的方式进行，24 h时间内病毒效价的峰值出现得早且高；MOI较低时，造成细胞发生二次感染，病毒繁殖不同步，病毒效价的峰值出现得晚且低。因此，对于复制较快且容易失活的TGEV，宜采用高MOI接种，尽可能确保细胞同步感染，使病毒产量在一定时间内达到最大，以缩短生产周期。为了确保生产过程中病毒效价，应选择1：500稀释种毒后接种ST细胞生产TGEV。

3.2微载体浓度越高，细胞生长期越长，采用10 mg/mL微载体培养达到最高细胞密度所需要的天数长，高浓度微载体的表面积未能充分被利用。为了更快更经济地获得较高密度的健康细胞，在大规模培养ST细胞时，应选择5 mg/mL的微载体浓度。

3.3 细胞活力参数P可以用来衡量细胞生理状况，P值越大，细胞生理状况越好；反之P值越小，细胞生理状况越差[6]。随着细胞培养时间增加，细胞活力参数P越小，由于TGEV的病毒复制较快且容易失活，尽可能确保细胞同步感染和病毒同步复制，使单位细胞产量在较短时间内达到最高，因此确定生产过程中TOI以接种72 h的ST细胞为宜。

3.4 DMEM中丰富的维生素、氨基酸对病毒毒价的提高有一定的帮助。补充血清反而使病毒毒价降低，这是因为血清中含有抑制病毒复制的成分。水解乳蛋白（LH）也含有分丰富的氨基酸和维生素等物质有利于病毒繁殖，同时由于水解乳蛋白价格稍便宜且成分较血清简单，制备疫苗后可降低过敏反应风险。因此，疫苗生产工艺中病毒维持液可选用含2 g/L LH的无血清低糖DMEM培养基。

试验结果表明，通过优化工艺参数可以促进TGEV在ST细胞中的繁殖；采用生物反应器培养TGEV对于提高病毒效价和节约生产成本是可行的，为病毒的后续研究奠定了基础。□□

参考文献略：（6篇，略）