高产漆酶菌株獴acillus 玸p. CLb的筛选及其对染料脱色效果的研究

李凡姝等

摘要

[目的] 为了筛选出一株高产漆酶的菌株。[方法]利用含铜的富集培养基从土壤中筛选出漆酶活性较高的菌株，结合形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析对菌株的分类地位进行鉴定，研究菌株的生长特性及菌株的芽孢漆酶对常用染料的脱色效果。[结果]该菌株属于芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. CLb。菌株CLb最适生长温度为37 ℃，最适生长pH为7.0，菌株能在含1 mmol/L Cu2+ 的培养基中生长，具有很强的耐铜性。以丁香醛连氮为底物，测定其芽孢漆酶活性，漆酶活性高达46.1 U/g干重。菌株CLb芽孢漆酶的最适pH为7.0。在介体乙酰丁香酮存在的脱色体系中，菌株CLb芽孢漆酶在4 h内对活性黑以及在2 h内对靛红的脱色率均达到930%，在6 h内对活性亮蓝和结晶紫脱色率分别为790%和92.5%。[结论] 菌株CLb芽孢漆酶在介体乙酰丁香酮存在的体系中对常用染料具有很高的脱色率。

关键词细菌漆酶；芽孢杆菌属；染料脱色

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01614-03Abstract[Objective] The research aimed to screen a strain with high laccase activity. [Method] Enrichment medium added with copper ions was used to screen bacteria with laccase activity from forest soil. A bacterium highly producinglaccase was identified by morphological， physiological and biochemical characteristics with 16S rDNA sequence analysis. The growth characteristics of the strain and the decolorization effect to dye were researched. [Result] The strain was identified as Bacillus sp. CLb. The optimum growth temperature of strain CLb was 37℃ and the optimum growth pH was 7.0. The strain CLb could grow in culture medium containing 1 mmol/L Cu2+. Its spore laccase activity was 46.1 U/g dry weight used syringaldazine as substrate. The optimum pH of the spore laccase was determined 7.0. When acetosyringone was added to the decolorizing system， its spore laccase could decolorize 93.0%， 93.0%， 79.0% and 92.5% of reactive black 5 in 4 hour， indigo carmine in 2 hour， reactive blue 19 and crystal violet in 6 hour.[Conclusion] The spore laccase of strain CLb could decolorize commonly used dyes well in acetosyringonesystem.

Key words Bacterial laccase； Bacillus； Dye decolorization

漆酶（EC 1.10.3.2， pdiphenol： dioxygen oxidoreductases）是一種含铜的多酚氧化酶，能够利用分子氧氧化各种芳香族和非芳香族化合物，同时完成多种底物的单电子转移，分子氧被还原为水[1]。漆酶参与生物合成和木质素降解。白腐菌漆酶对木质素的降解效果较好[2]。因此，真菌漆酶应用于木质素和纤维材料的修饰及去木质素方面有较好的前景。漆酶作用的底物范围很广，可应用于工业废水脱毒、纸浆造纸、纺织业和石化工业以及作为生物修复剂清理除草剂和杀虫剂[3]。

20世纪以前，对漆酶的研究主要集中在真菌漆酶[2]，对原核生物中漆酶的研究少有报道。Alexandre等[4]根据分子数据分析，提出漆酶基因可能广泛存在于细菌中。自1983年首次发现原核生物生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）具有漆酶活性[5]，随后陆续有报道证实海单胞菌（Marinomonas mediterranea）[6]、大肠杆菌（ Escherichia coli ）[ 7]、黄色链霉菌（Streptomyces galbus）[8]以及天蓝色链霉菌（S.coelicolor）[9]等菌株具有漆酶活性。虽然大多数细菌漆酶与真菌漆酶相比产量少且氧化还原电位较低，但是细菌漆酶具有不需糖基化，具有较好的热稳定性和pH范围广泛等优点[10]，使得细菌漆酶比真菌漆酶更适合基因操作和构建重组酶[11]。细菌生长繁殖速度较快，研究周期较短，使得高产漆酶菌株的筛选以及分离鉴定具有高效性。笔者从东北林业大学实验林场樟子松林的土壤中采集样品，利用含铜的富集培养基筛选出一株高产漆酶的细菌菌株CLb，通过形态学、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，将菌株CLb初步鉴定为芽孢杆菌属，并对菌株的生物学特性及其对染料的脱色效果进行研究，为细菌漆酶应用于染料脱色提供理论基础。

1.2.4

构建菌株CLb的系统发育树。将测定的结果在NCBI的BLAST上搜索比对，利用Clustal软件进行多序列比对，用Phylip3.69软件中的最大简约法构建该菌株的系统发育树。

1.2.5

菌株CLb的生物学特性研究。对菌株CLb的生长曲线、最适生长温度、最适生长pH、耐盐性以及Cu2+抗性等5个方面进行研究。

2 结果与分析

2.1菌株CLb筛选及其生理生化特性

从筛选的菌株中选取对丁香醛连氮显红色最深的一株细菌CLb进行研究。菌株CLb的革兰氏染色结果为蓝紫色，是革兰氏阳性细菌，细胞大小为（1 μm～2 μm）×（5 μm～7 μm），短杆状，有芽孢，具有侧鞭毛和荚膜；在LB固体培养基上，37 ℃培养24 h，菌落乳白色、扁平、呈圆形，菌落表面干燥、光滑，菌落边缘呈叶状，菌落不透明且正反颜色一致。

菌株CLb VP试验呈阳性，甲基红试验呈阳性，硝酸盐还原试验呈阳性，丙二酸盐试验呈阳性。芽孢杆菌CLb可利用麦芽糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、密二糖和乳糖。芽孢杆菌CLb含明胶液化酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和尿素酶。

2.3菌株CLb的生长特性

根据所测OD600数值，显示出菌株CLb在1～3 h之间生长缓慢；5～15 h进入对数生长期；25 h后进入稳定期。由图2可知，菌株CLb的最适生长温度为37 ℃，25～42 ℃时该菌株均能生长，但50 ℃下菌株几乎不能生长。由图3可知，菌株CLb的最适生长pH为7，pH 5～9菌株CLb生长良好，但是pH为4和11时菌株几乎不能存活。由图4可知，菌株CLb的耐盐性良好，菌株CLb能在NaCl浓度为1%～5%的范围内生长良好， NaCl浓度高于7%时菌株CLb生长缓慢。由图5可知，菌株CLb对Cu2+的抗性比较强。当培养基中Cu3 讨论

目前为止，细菌漆酶在生物技术上的应用越来越广泛，人们对其关注也越来越多，但是對其研究还远远不够，国内外对细菌漆酶的报道相对真菌漆酶还比较少。随着生物信息学技术的发展，人们发现越来越多的细菌具有漆酶活性。其中，最著名的细菌漆酶当属来源于枯草芽孢杆菌中的CotA蛋白，对其基因序列和催化结构的研究也日趋成熟[14]。

芽孢杆菌属的漆酶活性来源于芽孢外衣上。漆酶活性的高低与芽孢产量紧密相关。菌株CLb在LB固体培养基上培养5 d，芽孢产量达到最高，在菌体上滴加浓度1%丁香醛连氮溶液呈深红色。芽孢漆酶的酶活性可高达到71.53 U/g干重。虽然细菌漆酶比真菌漆酶的产量低，不易提取，氧化还原电位低，但是细菌漆酶有较好的热稳定性和耐碱性[11]。菌株CLb能在pH 5～9下生长，其芽孢漆酶的最适pH为7，而真菌漆酶一般在pH 3～6内显示活性[10]。该研究中筛选出的菌株CLb属于芽孢杆菌属，还没有鉴定到具体的种。由此可见，该菌株为一个新的种，还需要对菌株CLb进行全面的鉴定，并且对菌株CLb的芽孢漆酶的酶学性质开展进一步的研究。每年有越来越多新合成的染料被应用于纺织业[14]。许多合成染料是有毒的，具有致突变、致癌性，对人类健康有潜在的危害[15]。菌株CLb芽孢对活性黑和靛红有较好的脱色效果，在4 h以内脱色率均达到93%。其中，靛红是纺织业用于印染牛仔裤的染料，使用率非常高。可见，菌株CLb的芽孢漆酶在印染废水的处理上具有很大的潜力。

安徽农业科学2014年

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