采后菠萝果实品质及果胶分解酶活性的变化

叶玉平　夏杏洲　刘海　李江明　钟赛意

摘要[目的] 研究采后后熟软化过程中菠萝贮藏品质及果胶酶活性的变化，探讨菠萝果实成熟软化的原因。[方法]试验以菠萝为原料，测定常温贮藏过程中菠萝果实的色差、硬度、呼吸强度、可滴定酸（TA）、抗坏血酸（VC）、可溶性固形物（TSS）等品质指标，同时分析多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲酯酶（PME）、β半乳糖苷酶（βGal）3种果胶酶活性的变化。[结果]试验表明，菠萝果实的后熟软化是一个渐变的过程，随着果实成熟度的提高，其果肉硬度逐渐降低，呼吸强度、TSS及TA含量逐渐增强，VC含量先上升后下降。PG等果胶酶的活性先升后降，且与菠萝果肉硬度呈显著负相关，说明3种酶参与了菠萝果实的后熟软化。[结论] 研究可为菠萝果实贮藏保鲜提供理论依据。

关键词菠萝；非呼吸跃变型；贮藏品质；后熟软化

中图分类号S668.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02735-04

基金项目2009年广东海洋大学自然科学基金项目。

作者简介叶玉平（1988- ），男，湖南衡阳人，硕士研究生，研究方向：农产品保鲜与加工。*通讯作者，副教授，从事农海产品深加工研究。

菠萝[Ananas Comosus（L.）Merr.]又名凤梨，主要分布在我国广东、海南、福建等省区，是我国最具特色和竞争优势的热带水果品种之一，年产百万吨以上[1]。菠萝作为热带水果，不仅风味独特，营养也很丰富，具有很高的营养、保健和药用价值。

菠萝属非呼吸跃变型果实[2]，采后仍然进行着新陈代谢，期间涉及一系列复杂的生理生化反应过程。菠萝果实在后熟软化过程中，色、香、味发生明显变化，其中可溶性固形物（TSS）、可滴定酸（TA）、VC以及类胡萝卜素等物質的转化和形成具有重要意义[2]。大量研究结果表明，果实的后熟软化主要是因为细胞壁降解酶特别是PG等果胶酶含量增加及活性升高导致不溶性果胶转化为可溶性果胶，果实细胞壁降解，果实硬度下降。笔者研究采后后熟软化过程中菠萝贮藏品质及果胶酶活性的变化，探讨菠萝果实成熟软化的原因，以期为菠萝贮藏保鲜提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料菠萝：巴里种，采自广东湛江徐闻曲界镇。选择发育良好、无机械伤、无病害虫的鲜果于室温下贮藏。菠萝成熟度按以下方法界定：Ⅰ果眼较平，绿色果皮面积超过95%为全绿期；Ⅱ果眼较平，绿色果皮面积在80%～90%为绿熟期；Ⅲ果眼饱满，黄色果皮面积在70%～80%为黄熟期；Ⅳ果眼饱满，85%～90%果皮转黄为完熟期；Ⅴ全部转黄并且开始劣变为过熟期[4-5]。对每个时期果实取样并进行相关指标测定，并将取样后的果肉切碎后用液氮迅速冷冻，置于-20 ℃保存备用。

主要仪器：TMSPro食品物性分析仪，美国FTC公司；GR22GII高速冷冻离心机，日本日立HITACHI；UU2800AH紫外可见光分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；美菱BC/BD516DTF冷柜，合肥美菱股份有限公司；HH6数显电子恒温水浴锅，金坛市晶玻实验仪器厂；T25数显型分散机，德国IKA公司；WAY 手持式糖量折光仪，上海光学仪器厂；CR10色差仪，日本柯尼卡美能达公司。

1.2方法

1.2.1果皮颜色测定。采用CR10色差仪测定果皮颜色。分别在每个菠萝曲面上等距离的近端（近果冠一端）、中端、远端（近果蒂一端）各取4个点，即一个菠萝样品共12个测试点，每个点重复测定3次以上；每个成熟度各取3个菠萝测定色泽。用L、a、b值表示果实颜色：其中L表示亮度，范围从黑（0）到白（100）；a值的正值表示色泽红/紫，负值表示浅蓝/绿；b的正值表示黄，负值表示蓝[6]。

1.2.2果实硬度。使用TMSPro食品物性分析仪测定果实硬度。测定横切面距果心1 cm处果肉硬度（取样厚度1 cm），取近端、远端、中端3处，每处重复测定6次，以各处平均值计算[7]。

1.2.3呼吸强度。采用静置碱液吸收法[8]测定果实采后贮藏期间的呼吸强度。

1.2.4菠萝贮藏品质。可溶性固形物（TSS）含量测定：分别对不同成熟度的菠萝取样、匀浆、定性滤纸过滤、手持式糖量折光仪测定[9-10]；VC含量测定：2，6二氯酚靛酚法[11]测定，以1 kg菠萝含量计算；可滴定酸（TA）含量测定[11]：以柠檬酸计，单位mg/kg。

1.2.5果胶分解酶活性。

1.2.5.1PG提取及酶活性测定。参照文献[12-13]的方法，略有改动。以标准D半乳糖醛酸绘制标准曲线。在4 ℃条件下，5.00 g菠萝果实组织中加入20.0 ml 50 mmol/L Na醋酸缓冲液（pH 6.0，含2.4 mol/L NaCl）和少量石英砂及050 g PVP后在研钵中进行研磨，研磨2 min（低温库中），搅拌4 h后，以10 000 r/min离心30 min，上清液装入透析膜（MW cutoff12800纤维素膜，sigma），并在Na醋酸缓冲液（pH 45，含150 mmol/L NaCl）中透析24 h（透析液更换1次），上清液即为粗酶液。

酶活测定：在0.4 ml 0.2%的多聚半乳糖醛酸基质中加入0.1 ml粗酶液在40 ℃条件下反应1 h，反应完成后加入15 ml DNS试剂煮沸10 min，降至室温后稀释5倍在540 nm波长下测定OD值；对照在终止反应后加入酶液进行测定。定义40 ℃条件下1 g果实1 h生成1 mg D半乳糖醛酸为一个酶活性单位，以U表示。

1.2.5.2PME酶提取及活性测定。参照文献[12，14]的方法，略有改动。在4 ℃条件下，20.00 g果实组织中加入40.0 ml预冷的2 mol/L的NaC1溶液和少量石英砂及0.50 g PVP研磨2 min，然后以12 000 r/min离心20 min。上清液以“12.5.1”同样的透析膜在0.1 mol/L Na磷酸缓冲液（pH 75）中透析24 h（透析液更换1次），即得粗酶液。以0.1 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5 ）溶解的0.5%的果胶为基质。

酶活測定：0.3 ml果胶溶液中加入0.1 ml PME酶提取液和0.6 ml 0.1 mol/L 醋酸缓冲液（pH 5.5 ），30 ℃保温1 h，反应液冷却至室温后加入2 ml高锰酸钾-磷酸溶液，室温放置90 min，然后加入2 ml 10%草酸溶液，加热使其褪色，最后加入2 ml乙酰丙酮溶液，摇匀，沸水浴加热5 min，水浴冷却后于波长418 nm波长处测定其吸光度；以煮沸的酶液为对照。定义30 ℃条件下1 min生成1 mmol甲醇定为1个酶单位，以U表示。

1.2.5.3βGal酶提取及活性测定。参照文献[12]的方法，略有改动。在4 ℃条件下，5.00 g果实组织中加入20.0 ml 1.4 mol/L NaCl（pH 6.0）和少量石英砂及0.50 g PVP进行研磨，在冰池中搅拌1 h后以12 000 r/min离心20 min，上清液用透析膜（MWcutoff12800纤维素膜，Sigma）在0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中透析24 h（透析液更换一次），上清液即为粗酶液。

酶活测定：在0.1 ml酶液中加入0.5 ml 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 4.0）和0.4 ml BSA（0.1%清蛋白）及0.4 ml 16 mmol/L p硝基酚半乳糖苷（0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中溶解），将其混合液作为反应液，反应液在37 ℃条件下精确反应5 min后立即加入2 ml 0.2 mol/L的Na2CO3终止反应。在400 nm波长下测定游离的p硝基酚浓度。参比管在加入酶液、缓冲液和BSA后，即加入2 ml 0.2 mol/L Na2CO3，反应结束后再加入0.4 ml底物。定义在上述测定条件下，1 min分解底物生成1 μmol对硝基酚所需的酶量为1个βGal酶活单位，结果以U表示。

2结果与分析

2.1果实成熟软化过程中果皮颜色变化情况由图1可知，随着菠萝果实成熟度上升，菠萝果皮的a值和b值相应增大，与目测结果一致。其中b值的极差为26.69，a值的极差为15.53，即黄色加深更为显著，黄色多少可以作为判断菠萝的成熟度主要依据。

2.4.1TA含量变化。TA含量直接影响果实的风味品质，同时也是影响耐贮性的主要原因之一。在贮藏期间，水果中酸的含量和呼吸作用、微生物代谢以及水果腐烂程度有关。从图4可以看出，随着贮藏时间的增加，菠萝TA含量呈现上升趋势，且变化趋势明显，这可能和微生物的活动有关。

2.5.1PG酶活性的变化。PG酶是水解果胶的重要酶。为探讨PG酶在菠萝果实不同成熟期对果实软化的影响，该试验分析了菠萝果实在不同成熟期PG酶的活性，结果如图7所示。采后菠萝PG酶活性呈峰形变化，在贮藏前期活性逐渐增加，随着果实硬度下降，到成熟度Ⅲ时达到峰值，然后活性降低。相关性分析表明，菠萝果肉PG活性与硬度呈显著负相关（r=-0.735 0），表明采后菠萝果肉PG与硬度的下降密切相关，该酶对果实成熟中后期的快速软化产生较大的影响。

参考文献

[1] DULL G G.The pineapple：general[C]//HULME A C.The biochemistry of fruits and their products.London and New York：Academic Preas，1971：303-304.

[2] 屈红霞.唐友林.采后菠萝贮藏品质与果肉细胞超微结构的变化[J].果树学报，2001，18（3）：164-167.

[3] 刘明绶.菠萝皮中色素、果胶的提取纯化及性质研究[D].厦门：集美大学，2010.

[4] X.H.波钦诺克.植物生物化学分析方法[M].荆家海，丁钟荣，译.北京：科学出版社，1981：255-259.

[5] 张秀梅，杜丽清，孙光明，等.3个菠萝品种果实香气成分分析[J].食品科学，2009，30（22）：275-279.

[6] 段学武.冷激处理对香蕉采后生理生化的影响[D].广州：华南农业大学，2001：5-6.

[7] 徐绍颖.植物生长调节剂与果树生产[M].上海：上海科学技术出版社，1987.

[8] 刘玉杰，常世民.小篮子法测定植物呼吸速率实验中的两点说明[J].廊坊师范学院学报，2003，19（4）：110-111，113.

[9] 程昌风.柑橘果实采后病害生物防治[J].果树科学，1996，13（2）：124-126.

[10] 陈燕妮，胡位荣，黄雪梅，等.蜡处理对沙糖橘贮藏期间果实品质的影响[J].广东农业科学，2007（10）：64-67.

[11] 张宪政，谭桂茹.植物生理学实验技术[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，1989.

[12] 朴一龙，赵兰花，吴荣哲.梨果实在贮藏过程中果胶分解酶活性的变化[J].北方园艺，2009（4）：50-53.

[13] 王琳.耐贮性不同的梨贮藏中细胞壁成分和果胶分解酶活性变化[D].延安：延边大学，2010.

[14] 王清江，陈圭芳，李辉，等.乙酰丙酮吸光光度法测定白酒中甲醇含量[J].理化检验（化学分册），200，36（12）：541-542.

[15] 屈红霞，唐友林，谭兴杰，等.低温打蜡对贮藏菠萝黑心病控制的利用[J].广西植物，2000，20（1）：83-87.

[16] SEO S T，HU B，KOMRA M，et al.Dacus dorsalis and Vapour heat in paya [J].J Econ Entresol，1974，67：240-242.

[17] 陆新华，孙德权，吴青松，等.菠萝种质资源有机酸含量的比较研究[J].热带作物学报，2013（5）：915-920.

[18] 林新莲，宋勇强，曾梅娇.不同施肥处理对菠萝采后贮藏品质的影响[J].吉林农业，2012（9）：69-70.

[19] 王贵禧，韩雅珊.猕猴桃果实中PME、PG及其抑制因子的研究[J].中国农业大学报，1998，33（1）：88-94.

[20] RANWALA A P，SUEMATSU C，MASUDA H.The role of βgalactosidases in the modification of cell wall components during muskmelon fruit ripening[J].Plant Physiology，1992，100：1318-1325.