胡椒油树脂抗氧化性及抑菌性研究

刘笑　包振伟　顾林

摘要[目的]研究胡椒油树脂的抗氧化性及抑菌性。[方法]采用超声波辅助法提取黑、白胡椒油树脂，分别测定了2种胡椒油树脂的还原力、对DPPH·的清除力、抑制油脂过氧化能力以及抑菌活性。[结果]试验表明，2种胡椒油树脂的还原力相当，对DPPH·自由基有着较好的清除效果，浓度达到2 mg/ml后，清除率达到80%；黑、白胡椒油树脂对猪油和芝麻油2种油脂均具有较好的抗氧化作用，其抗氧化效果随胡椒油树脂浓度的增大而增强；黑、白胡椒油树脂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌均具有良好的抑制能力，最小抑菌浓度分别为7.5、7.5、15.0 mg/ml。[结论] 研究可为胡椒油树脂的进一步开发利用提供参考依据。

关键词胡椒油树脂；还原力；抗氧化；抑菌

中图分类号S509.9；TS202.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02731-04

基金项目“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD33B01）。

作者简介刘笑（1991- ），女，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏。*通讯作者，教授，从事农产品加工及贮藏研究。

自由基是生物体内新陈代谢过程中产生的一类具有高度活性的物质，含有未配对电子的物质[1]，过量的自由基能导致生物膜、酶、维生素、蛋白质及活细胞功能过氧化损伤，从而引发多种疾病，如肿瘤、动脉粥样硬化、心血管疾病等，对生物体危害很大。油脂和富含油脂的食品容易发生自动氧化，导致油脂出现哈败，严重影响油脂及食品的风味、色泽及组织，对油脂及食品品质产生不良影响，缩短货架期，甚至危害人体的健康。食品在加工及贮藏过程中很容易受到微生物的污染而导致腐败，影响食品的货架期，食用腐败变质的食品会对人体的肝脏、肾脏造成严重伤害，甚至可能引起癌症等疾病，对人体的生命造成威胁。食品工业中常采用人工合成的防腐剂来延缓食品腐败变质，但是长时间使用化学防腐剂也会导致畸形或慢性中毒等后果，因此亟需寻找高效的天然防腐剂和保鲜剂来替代人工防腐剂[2]。研究表明，某些植物的提取物能够有效抑制微生物的生长，作为防腐剂使用不仅安全无毒、性能稳定而且还能增加食物营养成分。近年的研究显示，一些植物的挥发性油、生物碱、酚类、不饱和长链脂肪酸等具有较强的抑菌性[3]。胡椒作为重要的香辛料之一，含有很多功能性物质，如胡椒精油、胡椒油树脂、月桂酸、硬脂酸等[4]，这些功能性物质能够瘦身[5]，减少炎症和疼痛[6-8]，保护肝脏，有效清除自由基[9]，减缓油脂自氧化[10]能力，还能有效抑制微生物的生长[11]，可以用作防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂等。

1材料与方法

1.1材料黑、白胡椒油树脂，以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法浸提所得[12]。主要试剂：无水乙醇、DPPH·自由基、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、铁氰化钾、三氯乙酸，均为分析纯。主要仪器和设备：UV2401 PC紫外可见分光光度计，日本Shimadu公司；HH6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；DGF30/7IA 电热鼓风干燥箱，南京实验仪器厂；生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；高压蒸汽灭菌锅，日本TUMY公司。

1.2试验方法

1.2.1DPPH·自由基清除能力。在10 ml试管中分别加入各浓度胡椒油树脂溶液2 ml及2.5×10-4 mol/L DPPH·2 ml，摇匀，暗处静置，30 min后于波长517 nm 下测定其吸光度Ai；同时测定2 ml DPPH·（2×10-4 mol/L，无水乙醇配置）溶液和2 ml无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 ml测定液与2 ml无水乙醇混合液的吸光度Aj，根据下式计算测定液对DPPH·的抑制率[13]。

抑制率（%）=（1-Ai-AjAc）×100%

1.2.2还原能力。采用普鲁士蓝法，取不同浓度梯度的样品溶液1.0 ml，加入2.5 ml的pH为6.6的磷酸缓冲液，2.5 ml质量分数为1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴保温20 min，然后加入2.5 ml质量分数为10%的三氯乙酸溶液，振荡混匀后，3 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml，加入5 ml蒸馏水和1.0 ml质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混匀后反应10 min，在波长700 nm处测定吸光值，并以相同浓度的VC水溶液做对照，吸光值越高，抗氧化性越好，还原力越强[14-16]。

1.2.3抗脂质过氧化能力。分别称20 g猪油和麻油6份置于100 ml具塞锥形瓶中，1份为空白对照组，4份分别添加2.0 ml胡椒油树脂溶液，1份加入0.2 mg VC作为阳性对照，混合均匀。置于（60±1）℃的烘箱中，每隔12 h搅拌1次，并且交换烘箱中内外锥形瓶的位置。每隔2 d取样检测猪油和麻油的过氧化值（POV）。

过氧化值的测定参考GB/T 5009.37-2003第一法：准确称取2～3 g混匀的样品，置于碘量瓶（250 ml）中，加入30 ml三氯甲烷-冰乙酸混合液（量取40 ml三氯甲烷，加60 ml冰乙酸混勻），立即摇动使样品完全溶解。加入1.0 ml饱和碘化钾溶液（称取14.0 g碘化钾，加10.0 ml水溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮于棕色瓶中），加塞后轻轻振荡30 s，放置暗处3 min。取出加水100 ml，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准溶液（浓度0.002 mol/L）滴定，待溶液变成淡黄色时，加入10 ml淀粉指示剂（10 g/L），继续滴定至溶液的蓝色消失为终点[17-19]。清除率按下列公式计算：

1.2.4抑菌能力。

1.2.4.1试验菌种。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（salmonella），由扬州现代乳品加工中心微生物实验室提供。

1.2.4.2培养基配制。LB培养基：1 000 ml锥形瓶中加入氯化钠10 g，蛋白胨10 g，酵母汁5 g，加水至1 000 ml，氢氧化钠调节pH至7，封装于试管中，121 ℃下灭菌15 min，即为LB液体培养基。LB固体培养基的制备是在液体培养基里加入琼脂（15 g/L）即可。

1.2.4.3菌悬液的制备。从4 ℃冰箱中取出菌种，用接种环挑取适量置于装有10 ml LB液体培养基的试管中，混匀，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，此为一代菌；继续从一代菌的菌液中吸取适量至装有10 ml LB液体培养基的试管中，37 ℃下培养24 h，即为二代菌。移取1 ml二代菌液到装有9 ml无菌水的试管中，混匀，再从该试管中移取1 ml菌液到另一个装有9 ml无菌水的试管中，以此类推，得到不同稀释倍数的菌悬液，用平板计数法计数，直至菌悬液浓度大约为107～108 CFU/ml，即为所需菌悬液，置于冰箱4 ℃保存待用。

1.2.4.4抑菌试验。采用琼脂打孔法[20]，将灭过菌的LB固体培养基加热成液态，趁热倒入培养皿中，静置冷却，即为LB平板。吸取0.1 ml 菌悬液（108 CFU/ml）于平板上，用涂布棒将菌悬液涂布均匀，待菌液挥发至干，用灭菌后的打孔器（直径11 mm）在每个平板打3个孔，除去孔内的培养基，使平板上的打孔处的中央形成一个凹面。在凹面内滴入不同浓度的胡椒油树脂丙酮溶液，用丙酮做空白对照试验。将平板转移到37 ℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4.5最小抑菌浓度（MIC）确定。采用2倍稀释法[21]，以丙酮作为溶剂，将胡椒油树脂配制成一系列梯度浓度的溶液，加入已融化好的培养基中，混合均匀。待培养基冷却凝固后，平板划线接种，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察结果，与对照组（仅添加丙酮溶剂）比较，肉眼可见有菌落生长为无抑制作用，肉眼可见完全无菌落生长的最小质量浓度作为MIC，以丙酮溶剂作对照。

2结果与分析

2.1胡椒油树脂对DPPH·的清除作用从图1可以看出，随着浓度的增加，黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂对DPPH·的清除率均逐渐增加，在1 mg/ml时清除率就超过50%，而浓度达到2 mg/ml后，清除率达到80%，此后基本保持不变。阳性对照VC对 DPPH·的清除率基本保持在80%以上。黑胡椒油树脂的清除效果略好于白胡椒油树脂，并且当两者浓度在2 mg/ml时和VC的清除效果相近。可见，黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂对DPPH·均有着良好的清除效果。

2.2胡椒油树脂的还原能力由图2可以看出，黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂的还原能力随着浓度的增加基本保持恒定，且两者相差很小，而阳性对照VC的还原能力随着浓度的增加逐渐加强，在浓度达到1.0 mg/ml后基本保持恒定。与VC相比，2种胡椒油树脂的还原能力较弱。

2.3胡椒油树脂对油脂抗氧化作用

2.3.1黑胡椒油樹脂对猪油抗氧化作用。由图3可以看出，添加黑胡椒油树脂的样品的过氧化值均低于空白样品（不添加胡椒油树脂），且随着添加量的增加，黑胡椒油树脂对猪油的抗氧化效果逐渐加强，空白样品在第4天过氧化值就超过20 meq/kg（食用油理化指标标准），而添加了8 mg黑胡椒油树脂的样品直到第8天过氧化值才超标，且与阳性对照VC相比，对猪油的抗氧化能力相差较小。由此可见，黑胡椒油树脂对猪油具有良好的抗氧化效果。

图3黑胡椒油树脂对猪油氧化的过氧化值的影响2.3.2白胡椒油树脂对猪油抗氧化作用。由图4可以看出，不同浓度的白胡椒油树脂对猪油均具有一定的抗氧化作用，随着添加量的增加，白胡椒油树脂对猪油的抗氧化效果逐渐加强，添加了8 mg的样品在第6天过氧化值还低于20 meq/kg，而空白第4天就超标了。但是对于相同添加量的油树脂，白胡椒油树脂的抗脂质过氧化能力低于黑胡椒油树脂。可见，白胡椒油树脂对猪油具有一定的抗氧化作用。

2.3.3黑胡椒油树脂对麻油抗氧化作用。由图5可以看出，空白样品在第8天过氧化值超标，添加了不同量的黑胡椒油树脂样品在第8天仍然能够符合卫生标准。图5中各条曲线的紧密程度反映出各个样品过氧化值相近相差程度，可以看出，在第8天之前，随着油树脂添加量的增加，麻油的过氧化值变化相差不大，各条线比较紧密。添加了8 mg黑胡椒油树脂的样品与添加阳性对照VC的样品氧化程度几乎一样，在第10天均未超标。可见，黑胡椒油树脂对麻油氧化作用具有较好的抑制效果。

2.3.4白胡椒油树脂对麻油抗氧化作用。图6反映了不同添加量的白胡椒油树脂对麻油氧化的抑制效果。和黑胡椒油树脂相似，随着添加量的增加，样品的过氧化值增长速度逐渐降低，2 mg黑胡椒油树脂添加量的样品在第6天符合卫生标准，第8天过氧化值超标，而8 mg白胡椒油树脂添加量的样品直到第10天才略微超标，且与阳性对照VC的效果相近。但是和黑胡椒油树脂效果相比，白胡椒油树脂对麻油的抗氧化效果略差，相同添加量时对麻油氧化的抑制作用略小于黑胡椒油树脂。

2.4胡椒油树脂体外抑菌

2.4.1黑胡椒油树脂体外抑菌。表1是不同浓度黑胡椒油树脂对3种致病菌：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的抑制效果，效果通过抑菌圈的直径显示，抑菌圈直径越大，抑制效果越强。从表1中可以看出，随着胡椒油树脂浓度的降低，3种菌收到的抑制效果均逐渐下降，可以得出抑菌效果和胡椒油树脂浓度正相关。对比相同油树脂浓度时3种受试菌的抑菌圈直径可以发现，黑胡椒油树脂对3种受试菌的抑制效果为：金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>大肠杆菌。由此可见，黑胡椒油树脂具有良好的抑菌性。

2.4.2白胡椒油树脂体外抑菌。由表2可以看出，和黑胡椒油树脂相似，抑菌效果和白胡椒油树脂浓度正相关，浓度越低，抑菌效果越差。白胡椒油树脂对3种受试菌的抑制效果为：金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>大肠杆菌。对比表1和2可以得出，白胡椒油树脂的抑菌效果略低于黑胡椒油树脂，尤其在浓度较低时，两者抑菌效果相差较大。可以得出，在适当的浓度下，黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂均有较好的抑菌性。

2.4.3胡椒油树脂的最小抑菌浓度。从表3可以看出，2种胡椒油树脂的最小抑菌浓度相同，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌最小抑菌浓度分别为7.5、7.5、15.0 mg/ml。2种胡椒油树脂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌均具有良好的抑制能力。

3结论

以黑白胡椒油树脂为原料，通过测定其对DPPH·自由基的清除能力、还原力、抗脂質过氧化能力以及对3种常见致病菌的抑制能力，测定其抗氧化活性及体外抑菌活性，得出以下结论：①DPPH·自由基清除力。黑胡椒油树脂的清除效果略好于白胡椒油树脂，当两者浓度在2 mg/ml时和VC的清除效果相近，清除率达到80%以上。两者对DPPH·自由基均具有良好的清除能力。②还原能力。黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂还原能力相当，与阳性对照相比，相对较弱，还原能力不强。③抗脂质过氧化能力。黑胡椒油树脂的对猪油和麻油的抗氧化能力均强于白胡椒油树脂，添加了胡椒油树脂的麻油和猪油样品可以增加保质期，延长货架期。考虑到成本的问题，在食用油中只需按8 mg/20 g油的比例添加胡椒油树脂，可以达到与VC相近的效果。④体外抑菌活性。黑胡椒油树脂和白胡椒油树脂对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌，最小抑菌浓度分别为7.5、7.5、15.0 mg/ml，当浓度达到0.10 g/ml时，抑菌圈直径均在11 mm以上，可见黑白胡椒油树脂均具有较好的抑菌能力。

参考文献

[1] HAMILTON R J，KALU C，PRISK E，et al.Chemistry of free radicals in lipids[J].Food Chemistry，1997，60（2）：193-199.

[2] 于智峰，赵立庆，郑君君，等.天然防腐剂在肉制品中的应用[J].中国调味品，2012，37（3）：12-21.

[3] KHAN M R，KIHARA M，OMOLOSO A D.Antimicrobial activity of the alkaloidal constituents of the root bark of Eupomatia laurina[J].Pharmaceut Biol.，2003，41（4）：277-280.

[4] 邬华松，杨建峰，林丽云.中国胡椒研究综述[J].中国农业科学，2009，42（7）：2469-2480.

[5] 王颖，姜子涛，李荣.黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力的比较[J].中国调味品，2009，34（5）：50-53.

[6] GUPTA S K，BANSAL P，BHARDWABJ R K，et al.comparative antinociceptive，antiinflammatory and toxicity profile of nimesulide vs nimesulide and piperine combination[J].Pharmacological Research，2000，41（6）：657-662.

[7] LEE E B，SHIN K H，WOO W S.Pharmacological study of piperine [J].Arch Pharm Res，1984，7（2）：127-132.