健膝丸含药血清对IL—1β作用下兔关节软骨细胞Type—II Collagen、MMP—1、MMP—13蛋白表达的影响

王淑静 赵敏 娄玉钤 张广辉 李坚 赵幸熬

【摘 要】目的：观察健膝丸含药血清对白细胞介素-1β（IL-1β）作用下体外培养的兔关节软骨细胞表达II型胶原（Coll-II）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的影响，探讨健膝丸防治骨关节炎的作用机制。方法：提取1月龄的兔关节软骨细胞、Ⅰ代细胞用于实验。实验分为空白组、模型组、健膝丸组和抗骨增生组。细胞在培养第4天时，模型组、健膝丸组和抗骨增生组分别加入10 ng·mL-1 的IL-1β继续进行培养，分别在培养24 h、48 h、72 h时提取蛋白，并用In-cell western blot法检测其表达情况。结果：各时间点空白组与模型组Coll-II、MMP-1及MMP-13的表达比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）；健膝丸组较模型组Coll-II的表达在48 h、72 h时，差异有统计学意义（P < 0.05）；MMP-1及MMP-13表达在各时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。结论：健膝丸可能在刺激软骨细胞分泌Coll-II，或者减轻对Coll-II的破坏，及减少MMP-1、MMP-13表达等途径发挥作用，从而促进软骨细胞增殖和延缓软骨基质降解，具有保护软骨细胞、延缓软骨基质降解的作用，临床上可作为骨关节炎的治疗用药。

【关键词】 软骨细胞；健膝丸；骨关节炎；Coll-II；MMP-1；MMP-13；兔

健膝丸是全国名老中医药专家娄多峰教授治疗骨关节炎（osteoarthritis，OA）的经验方，由制首乌、淫羊藿、千年健、海桐皮、鸡血藤、川牛膝、木瓜等组成，具有补肝肾、强筋骨、祛风除湿、通络止痛、活血化瘀等功效。临床疗效观察中，健膝丸能明显改善膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的早、中期症状，缓解病情，并能减缓或终止膝关节间隙狭窄和骨质增生；能明显缓解KOA晚期症状，提高患者生活质量。前期研究表明，健膝丸可减少软骨II型胶原和蛋白多糖丢失[1]；使血清SOD活性下降，MDA及NO含量升高[2]。本实验采用In-cell western blot方法，观察健膝丸含药血清对白细胞介素-1β（IL-1β）作用下体外培养的兔关节软骨细胞表达II型胶原（Coll-II）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的影响，以期探讨健膝丸治疗OA的作用机制和影响途径。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级新西兰大白兔，雌雄兼用，平均体质量2.5 kg。由上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（沪）2004-2007。

1.2 实验药品 ①健膝丸（河南风湿病医院制剂室提供，豫药制字Z04010009，批号20080702），药物组成：制首乌、淫羊藿、千年健、海桐皮、鸡血藤、川牛膝、木瓜等。②抗骨增生胶囊（江苏康缘药业股份有限公司生产，国药准字Z10980006，批号081008），药物组成：熟地黄、鸡血藤、肉苁蓉、莱菔子、狗脊、骨碎补、女贞子、牛膝、淫羊藿等。每粒0.35 g。

1.3 试剂与仪器 Gibco F12培养基、胰酶、胎牛血清，PBS缓冲液，Sigma II型胶原酶，Peprotech重组鼠IL-1β细胞因子，BCA蛋白定量试剂，北京博奥森MMP-1、MMP-13、Coll-II多克隆抗体；二氧化碳培养箱，酶标仪，J-25高速离心机，LI-CORs Odyssey双色红外激光成像系统等。

2 方 法

2.1 含药血清的制备 取2月龄清洁级新西兰大白兔12只，雌雄各半，体质量2.5 kg左右。按照实验动物与人体表面积折算的等效剂量比值，换算动物的给药剂量。空白组给予生理盐水2 mL·kg-1灌胃，健膝丸组给予健膝丸水溶液0.56 g·（2 mL）-1·kg-1灌胃，抗骨增生组予以抗骨增生胶囊水溶液

0.245 g·（2 mL）-1·kg-1灌胃；连续给药7 d，每日2次；于末次给药3 h后，心脏采血取血清，静置30 min后，3 500 r·min-1离心15 min，收集血清，灭活后置于-20 ℃的冰箱中保存。

2.2 兔关节软骨细胞的培养 取体质量为1.5 kg、

1月龄的新西兰大白兔1只，水合氯醛麻醉处死；在无菌环境下切取关节软骨，用含有双抗（青霉素100 U·mL-1，链霉素100 μg·mL-1）的无菌PBS缓冲液漂洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小；置于37 ℃恒温摇床内，分别用质量分数0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶消化；收集消化产物，并将其离心后弃掉上清液；加入含有质量分数15% FBS的F12培养液，按2×105·cm-2的密度接种细胞；置于体积分数5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养；根据细胞生长状况换液。待细胞融合并铺满瓶底80%以上时可传代，以Ⅰ代软骨细胞用于实验。

2.3 实验分组 实验分为空白组（20%正常兔血清+F12培养基），模型组（20%正常兔血清+F12培养基+IL-1β），健膝丸组（20%健膝丸含药血清+F12培养基+IL-1β），抗骨增生组（20%抗骨增生胶囊含药血清+F12培养基+IL-1β）。

2.4 检测方法 采用In-cell western blot方法检测。将Ⅰ代软骨细胞接种在96孔培养板中，细胞贴壁后，吸出含有FBS的培养液，重新加入不含血清的F12培养基；运用血清饥饿法将细胞同步24 h，洗清牛血清对细胞的影响，使所有细胞均处于G0期。之后按照实验分组分别加入相对应的培养液，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培養箱中培养。培养第4天时，模型组、健膝丸组和抗骨增生组分别加入10 ng·mL-1的IL-1β继续培养。采用In-cell western blot法分别在培养24 h、48 h、72 h时，提取蛋白并检测。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，各组间差异显著性检验采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组Coll-II表达的比较 空白组与模型组在各时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明IL-1β可以明显减少Coll-II的表达。健膝丸组与模型组比较，在24 h时，差异无统计学意义

（P > 0.05）；但在48 h、72 h时，差异有统计学意义（P < 0.05）；且健膝丸组的Coll-II蛋白表达与时间呈正相关；而抗骨增生组与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），说明健膝丸可以有效抑制IL-1β对Coll-II的降解与破坏，而抗骨增生胶囊没有此作用。见图1A。

3.2 各组MMP-1表达的比较 空白组与模型组在各时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明IL-1β可诱导和激活MMP-1的表达作用。健膝丸组与模型组比较，在各时间点差异均有统计学意义（P < 0.05），说明健膝丸可抑制IL-1β对MMP-1的表达。抗骨增生组与健膝丸组比较，在24 h时，差异无统计学意义（P > 0.05）；在48 h、72 h时，差异有统计学意义（P < 0.05），说明抗骨增生胶囊较健膝丸可以更好地抑制IL-1β诱导和激活MMP-1的表达作用。见图1B。

3.3 各组MMP-13表达的比较 空白组与模型组在各时间点比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明IL-1β可有效地诱导和激活MMP-13的表达作用。健膝丸组与模型组比较，在各时间点差异有统计学意义（P < 0.05），说明健膝丸可抑制IL-1β对MMP-13的诱导和激活。健膝丸组与抗骨增生组比较，在24 h时，差异无统计学意义（P > 0.05）；在48 h、72 h时，差异均有统计学意义（P < 0.05），说明健膝丸较抗骨增生胶囊有更好的抑制IL-1β诱导产生MMP-13的作用。见图1C。

4 讨 论

OA属中医学“骨痹”“肾痹”“膝痹”等范畴[3]。娄多峰教授致力于OA的发病与治疗研究几十载，认为其发病应与“虚邪瘀”密切相关，其中正虚是其发病的内在因素，邪侵是发病的重要条件，“不通”是发病的病理关键。健膝丸正是基于“虚邪瘀”的理论基础指导下，结合娄多峰教授多年的临床经验拟定而成[4]。

在软骨的形成、代谢以及修复中，软骨细胞起着极其重要的作用。若软骨细胞的凋亡超出一定的范围，会导致软骨细胞数量减少，一方面引起软骨基质合成与分泌的减少，另一方面引起维持软骨基质合成与降解酶系统平衡的紊乱，最终引起软骨基质的质与量发生变化。软骨基质的这种变化又会促进软骨细胞的凋亡，从而导致软骨退变。软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者在力学因素与生物学因素的作用下，分解与合成代谢出现紊乱，从而导致了KOA的发生。

IL-lβ是一种强大的炎症细胞因子，能刺激软骨细胞和滑膜细胞分泌前列环素2（PGE2）、胶原酶，从而引起滑膜炎症和骨的吸收。另外，IL-lβ还可加速软骨基质中蛋白多糖和Coll-II的降解，并抑制它们的合成，进而抑制软骨细胞增殖，诱导细胞凋亡，进一步加快OA的进展[5]。随着OA病情的进一步发展，IL-lβ的表达会持续的增高；所以，IL-lβ被认为是OA发生和进展过程中最重要的炎症因子之一[6-7]。IL-lβ同时还可以上调软骨细胞的炎性介质，如软骨局部基质金属蛋白酶（MMPs）水平[8]，一方面加速软骨退变，另一方面抑制软骨修复，使软骨自动降解，最终发展成OA。研究表明，MMPs广泛存在于各种结缔组织中，是一类Zn2+、Ca2+依赖的蛋白水解酶家族，在细胞外基质（ECM）的生理和病理降解过程中起重要作用，它的异常增高可能是导致ECM合成与降解失衡的重要原因。其中MMP-1和MMP-13具有强烈降解Coll-II和蛋白多糖的作用[9-10]。由于二者是组成ECM的主要大分子，因此，Coll-II和蛋白多糖过度的降解也导致了OA的发生。

本实验采用In-cell western blot的方法，即在细胞内环境定量目标蛋白，并通过近红外检测蛋白，具有灵敏度高、定量准确、双色检测的优点[11]。

通过观察健膝丸含药血清对IL-1β作用下兔关节软骨细胞Coll-II、MMP-1、MMP-13表达的影响，研究健膝丸防治OA的作用机制。从实验结果可知，与模型组及抗骨增生组比较，健膝丸组Coll-II的表达显著增高，MMP-1、MMP-13的表达明显减少，表明健膝丸可能在刺激软骨细胞分泌Coll-II或者减轻对Coll-II的破坏及减少MMP-1、MMP-13表达等途径中发挥作用，从而促进软骨细胞增殖和延缓软骨基质降解，在OA的病理过程中起着正向调节Coll-II代謝的作用。上述研究为健膝丸用于临床OA的治疗提供了理论和实验依据。

5 参考文献

[1] 李坚，娄玉钤，李满意，等.健膝丸对大鼠膝骨关节炎组织形态学的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（1）：13-17.

[2] 赵幸熬，娄玉钤，张广辉，等.健膝丸对大鼠SOD、MDA、NO的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（9）：37-40.

[3] 娄玉钤.中医风湿病学[M].北京：人民卫生出版社，2010：113-114.

[4] 娄玉钤，娄高峰，娄多峰，等.基于“虚邪瘀”理论的风湿病学科体系建立及相关研究[J].风湿病与关节炎，2012，1（1）：10-15.

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收稿日期：2014-03-26；修回日期：2014-06-13