橡胶草种植前后土壤微生物细菌多样性研究（Ⅰ）

梁素钰　李琳　杜倩等

摘要[目的]对开垦荒地种植橡胶草前后的土壤微生物细菌多样性进行454测序技术并对基础数据进行分析，探求利用边际土地进行战略能源作物种植的可行性。[方法]通过蛇形取样法对土壤样品采集、用试剂盒提取土壤微生物总DNA、选择细菌16SrDNA V3～V1区，进行引物设计与PCR预扩增，采用454测序技术获得数据序列并优化，用R软件进行指数多样性等基础分析。[结果]样品总DNA无蛋白质和RNA污染，PCR预扩增出500 bp左右的细菌16S rDNA。454测序序列优化序列占有效序列的90%以上，在97%相似性水平下的指数多样性显示橡胶草种植后土壤细菌OTU数目较多；ShannonWiener曲线和稀释性曲线显示，当测序序列细菌超过15 000时曲线趋向平坦。[结论]试验测序数据可以反应样品中绝大多数微生物信息，此次取样的数量比较合理，细菌丰富度高。

关键词橡胶草（Taraxacum koksaghyz Rodin）；454测序；细菌；多样性；土壤微生物

中图分类号S576文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02563-02

基金项目国家林业局948，编号201304SC2，2011451；黑龙江省财政，编号201102；黑龙江省森工总局，编号sgzjY2012010；黑龙江省博士后，编号LBHQ10010）。

作者简介梁素钰（1970- ），女，黑龙江哈尔滨人，副研究员，博士，从事生物能源与技术研究。

橡胶草（Taraxacum koksaghyz Rodin）是菊科（Compositae）蒲公英属（Taraxacum）多年生宿根草本产胶植物，首先于20世纪30年代在前苏联被发现，并對橡胶草体内橡胶的形成[1-2]及品质变化[3-4]、体内碳水化合物[5-6]、果聚糖[7]、多酚氧化酶及化合物[8-9]和脱氢酶[10]等进行了研究。中国在20世纪50年代初，为解决国内天然橡胶供应不足问题，中央轻工业部曾组织调查团前往新疆对发现的大面积野生橡胶草进行全面考查[11-12]。

近年来，随着橡胶草作为替代巴西橡胶的可用资源之一[13-17]，人们对橡胶草的研究维度更加多样化，从田间种植[18]，组织培养[19-22]、到分子水平的蛋白质[23-24]、转基因[25-27]、遗传图谱多样性[28]和基因克隆[29-30]等进行了一系列的研究。笔者主要是利用454技术[31-32]研究北方田间种植橡胶草前后的土壤微生物细菌的多样性，并对所测序列进行基础数据分析，以期为橡胶草的进一步开发利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料于种植1年橡胶草的土地和未种植地，以5 m×5 m为试验单元，尽量靠近橡胶草根蛇形取土样5个，每个样品50.0 g，混合，过40目土壤筛。样品用锡纸包裹，置于液氮中带回实验室。试验中用KOK表示橡胶草种植后的样本，用CK表示橡胶草种植前的样本。

1.2方法

1.2.1土壤总基因组的提取与纯化。利用土壤DNA提取试剂盒（PowerSoil DNA Isolation Kit）进行微生物基因组DNA的提取和纯化，土样取0.25 g，提取完成后，取1 μg DNA上样，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2454测序进行PCR扩增时引物选择。检测细菌选择16SrDNA V3～V1区，进行引物设计与PCR扩增。扩增引物为 27F：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3；533R：5TTACCGC GGCTGCTGGCAC3（测序端）。

1.2.3有效序列数据及优化序列数据。对2个样品混合测序后，去除测序接头、barcode和前引物（forward primer）序列，并对处理后的有效序列和优化序列数据进行分布统计。

1.2.4OTU聚类分析。对所测细菌序列进行归类操作，按照彼此的相似性归为许多小组，1个小组就是1个OTU（Operational Taxonomic Units，可操作的分类单元），来自1个菌。试验基于97%的相似度，对所有细菌序列进行OTU聚类并进行生物信息统计分析。

1.2.5多样性分析。试验使用R软件，应用菌群丰度指数Chao、Ace，菌群多样性指数Simpson、Shannon和测序深度指数Coverage和ShannonWiener曲线反应样品的微生物多样性指数，用稀释性曲线比较测序数量不同的样本物种的丰富度和样本的取样大小。

2结果与分析

2.1DNA的提取与PCR扩增图1表明，2个样品均获得质量良好的总DNA，无蛋白质和RNA污染，可进行PCR扩增。细菌PCR均预扩增出500 bp左右的条带，无拖尾现象。

注：M为DL2000；90为KOK；100为CK；（a）为样品总DNA；（b）为细菌16srDNA PCR。

2.2样品序列数据的分析由表1可知，优化后的序列长度占有效序列的90%以上，满足试验分析要求。

2.3橡胶草土壤细菌多样性分析

2.3.2ShannonWiener曲线分析。图2表明，这2个样本的曲线离得比较近，当细菌测序序列超过15 000时，曲线趋向平坦，说明试验选取细菌测15 000条序列时能反应样品中绝大多数微生物信息，所测序的数据具有高的可信度，可真实地反应试验结果。

2.3.3稀释性曲线（rarefaction curve）分析。该分析是在97%相似性水平下划分OTU并制作样品的稀疏曲线，当细菌达到15 000，曲线有趋向平坦趋势，说明此次取样的数量比较合理（图3）。注：90为KOK；100为CK。

3结论与讨论

试验主要针对土壤样品的采集、DNA的提取、PCR预处理以及获得样品的测序数据进行的基础分析。用454技术研究土壤微生物，在土壤样品的准备上，为了尽可能接近土壤内真实微生物的组成，在取样时第一时间将样品原地处理后，存于液氮中保存。但在试验过程中，DNA的提取、纯化以及PCR引物的设计和扩增，都会对所测序列产生影响。该试验中的PCR是预试验，主要目的是为了检测基因组DNA是否可以进行后续的454测序。

序列优化是为了去除测序过程中出现的冗余数据，其中不含所设计序列的数据不可用于后续分析。试验数据分析是在0.03水平上，即97%相似性，选取数据并进行分析。在分析过程中，也可以根据需要选取0.1或者0.01等不同程度的相似性水平所获得的数据，那就要看实际优化的序列是否可以满足试验分析要求。