玉米转录因子ABP9瞬时表达体系的建立

陈晓晶　潘振　赵军

摘要[目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理。[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体，通过PEG介导的转化方法，建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统。利用该系统，通过反转录PCR和Western blot分别检测ABP9genomic∷FLAG融合基因在原生质体中的转录和翻译；并通过转化ABP9∷GFP融合表达载体和GFP荧光检测，对ABP9进行亚细胞定位。[结果]玉米原生质体瞬时表达ABP9系统中，ABP9genomic∷FLAG融合基因能够正确转录出mRNA并翻译出蛋白质；利用该系统进行亚细胞定位结果显示ABP9定位于细胞核中。[结论]玉米原生质体瞬时表达ABP9体系的建立，为进一步探究玉米中ABP9的表达和调控提供了良好的实验系统。

关键词玉米（Zea mays L.）；转录因子；ABP9（ABRE Binding Protein 9）；原生质体瞬时表达

中图分类号S513文献标识码A文章编号0517-6611（2014）09-02554-05

基金項目国家转基因生物新品种培育重大专项（编号：2013ZX08003-004）。

作者简介陈晓晶（1988-），女，河北晋州人，硕士研究生，研究方向：植物抗逆分子生物学。*通讯作者，研究员，博士，从事植物抗逆分子生物学和基因工程研究。

玉米（Zea mays L.）是全球种植范围最广、产量最大的谷类作物，居3大粮食（玉米、小麦和大米）之首[1]。据统计，目前我国玉米种植面积为35 029 820×103 km2，总产量20 561.41×104 t，玉米已经成为我国种植面积最大、总产量最高的粮食作物（国家统计局 2012）。玉米同时也作为重要的饲料作物和工业原料，是世界粮食安全和能源安全不可或缺的一部分。然而，自然环境下，玉米的生长经常受到干旱、低温、盐渍等逆境的胁迫，严重影响玉米的产量，威胁粮食安全。

转录因子在调控植物生长发育、繁殖、胞间信号、细胞周期、代谢以及应答外界环境中起着重要的作用[2]。近年来，研究者相继从高等植物中分离出一些调控逆境相关基因表达的转录因子。增强一个转录因子的作用，就可通过其促使多个抗逆基因发挥作用。因此，在植物抗逆分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，改良或增强一个关键的转录因子是综合改良植株性状更为有效的方法和途径[3]。

bZIP转录因子是真核生物中分布最广泛、最保守的一类转录因子。实验室前期工作通过酵母单杂交的方法，从授粉后17 d的玉米幼胚cDNA文库中筛选出了与玉米Cat1（catalase isozyme 1）基因顺式元件ABRE2相互作用的bZIP类转录因子ABP9（ABRE Binding Protein9），并证明其在酵母细胞中具有转录激活功能[4]。基因枪转化玉米悬浮细胞瞬时表达分析表明，ABP9在植物细胞中也具有ABRE结合特性和转录激活功能[5]。已有研究通过转基因的手段，分析了转ABP9基因的拟南芥[5]、小麦[6]、黑麦草、高羊茅[7]、水稻[8]等的耐非生物逆境的抗性，结果表明ABP9过表达植株对干旱、寒冷和盐渍等非生物胁迫的耐受能力明显增强。Zhang等研究表明，过表达ABP9的拟南芥中，ABP9通过调节一系列ROS清除相关的抗氧化酶类基因（CSD1，CAT3等）的表达以及ROS 信号传导相关的调节基因（Zat10，SRO5等）的表达，参与植物体内 ROS代谢的调节；ABP9还通过调节多种逆境/ABA应答相关功能基因（COR15a，KIN1，RD29B等）和调节基因（CBF1，PP2C，MYB2等）的表达，参与ABA信号传导和寒冷、干旱、盐渍等逆境防御反应，从而提高植物耐多种非生物逆境的能力[9-10]。前期研究中，实验室发现ABP9可能存在某种特殊的转录后调控机制。

植物中瞬时表达系统具有检测速度快、高通量等特点，结合报告基因GUS[11]、CAT[12]、LUC[13]、GFP[14]、EGFP[15]等使用，该技术被广泛地用于基因功能分析的研究，如基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测以及蛋白间互作等[16]。原生质体作为常用的植物瞬时表达系统，是比较均一的单细胞体系；且不需要进行长时间的组织培养，制备检测过程仅需2 d时间[17]。胡萝卜、烟草、玉米原生质体瞬时表达系统[18]、土豆[19]、白云衫[20]、大麦[21]、标准的拟南芥瞬时表达系统[22]、优化的水稻瞬时表达系统[23]等原生质体瞬时表达系统相继建立，为研究蛋白的亚细胞定位和基因的表达调控提供了方便而有效的试验系统。Izawa等利用水稻原生质体瞬时表达系统研究了水稻bZIP类转录激活子RITA1对籽粒发育过程中相关基因的表达调控[24]；Yanagisawa等利用玉米叶片原生质体瞬时表达分析了玉米Dof锌指蛋白参与组织特异性光调控相关基因的表达[25]；Gu等利用拟南芥原生质体瞬时表达研究了番茄转录因子Pti4、Pti5和Pti6在防御应答中的激活作用[26]；李妮娜等建立棉花叶肉原生质体瞬时表达系统，并利用该系统研究了棉花转录因子GhZFP2的亚细胞定位[27]。

因此，建立ABP9转录因子的玉米原生质体转化体系对此基因的进一步功能和调控分析和转基因植株构建具有重要意义。笔者用PEG介导转化的方法，成功建立了玉米叶肉原生质体较高效的瞬时表达ABP9系统，并利用该系统对转录因子ABP9进行了初步分析，以期为进一步阐明ABP9在玉米中的功能及转录后调控机制奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。将玉米自交系Qi319饱满的种子播种于土（蛭石∶泥炭土=1∶1）中，置于培养箱中暗培养2周左右，选取第2片伸展的叶子作为提取玉米原生质体的材料。

1.1.2主要仪器。PCR仪，购自杭州柏恒科技有限公司；Centrifuge 5810R高速离心机和Centrifuge 5804，均购自eppendorf公司；THZC1台式冷冻恒温振荡器，购自太仓市实验设备厂；DYY6C型核酸电泳仪，购自北京六一化学仪器厂；可控恒温金属浴仪，购自金银杏生物公司。

1.1.3主要试剂。4吗啉乙磺酸（MES）、纤维素酶R10、离析酶R10、D甘露醇、KCl 、CaCl2、BSA、MgCl2、PEG4000等原生质体提取所用试剂及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、二硫苏糖醇（DDT）、十二烷基硫酸钠（SDS）等Western blot所用试剂，均购自Amresco公司；金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司；各种限制性内切酶和修饰酶，购自NEB公司；TRIzol reagent购自Invitrogen公司；反转录试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；测序均由北京博艾永华生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1亚细胞定位載体构建。pCAMBIA130335SGFPTnos表达框由花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、GFP报告基因、胭脂碱合成酶终止子（NOS）构成。设计2端带有XbaI和BglII酶切接头的引物（ABP9XbaIFW：5′gagatctagaatggcgtcggagac3′；ABP9BglIIRV：5′cgtcagatctaccatccacatggcgctg3′，下划线处为酶切位点）；PCR方法用TransStart FastPfu高保真酶从pCAMBIA3301PubiABP9Tnos载体上扩增目的基因ABP9的cDNA序列，扩增产物回收后双酶切，经T4 DNA连接酶连接到双酶切的pCAMBIA130335SGFPTnos载体上，连接产物转入DH5α感受态细胞，转化子经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后，获得ABP9∷GFP融合载体pCAMBIA130335SABP9GFPTnos。按照说明书用金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒，-20 ℃保存备用。

1.2.2瞬时表达目的基因载体的构建。瞬间表达载体pUC1935S3FlagTnos的表达框由花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、3Flag标签、胭脂碱合成酶终止子（NOS）构成；pCAMBIA3301Pabp9 GFPABP9genomicTnos用于制备目的基因片段，二者均由实验室保存。设计2端带有XhoI和BstBI酶切接头的引物（FW：5′ ccgctcgagatggcgtcggagaccacc3′；RV：5′gcttcgaaccacatggcgctgcccgag3′，下划线处为酶切位点）；用与亚细胞定位载体构建相同的方法将ABP9基因组序列连接到pUC1935S3FlagTnos载体上，构建载体pUC1935SABP9genomic3FlagTnos。

1.2.3玉米原生质体制备。将玉米叶片去两端切成约0.5 mm细丝，把切好的叶片放入含有酶解液（将1.5%纤维素酶R10，0.4%离析酶R10，0.4 mmol/L D甘露醇，20 mmol/L KCl，20 mmol/L MES（pH 5.7）混合液置于55 ℃水浴10 min，冷却至室温后，加入10 mmol/L CaCl2，0.1%BSA，并用0.45 μm滤膜过滤到培养皿中）的培养皿中，室温黑暗中振荡（转速为30 r/min）酶解7 h。使用200目尼龙滤网过滤酶解液，100×g离心2 min，沉淀原生质体。移除上清液，加入预冷的缓冲液W5（2 mmol/L MES（pH 5.7），154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl），洗涤沉淀1次，离心后弃上清液，再次加入W5，重悬沉淀，置于冰上30 min。再次100×g离心2 min，弃上清液，加入适量的MMg溶液（4 mmol/L MES，0.4 mmol/L D甘露醇，15 mmol/L MgCl2），备用。

1.2.4PEG介导原生质体转化。吸取10 μg质粒于2 ml圆底离心管中，加入制备好的200 μl原生质体溶液混匀，加入等体积30%PEGCa2+溶液（30%PEG4000，200 mmol/L甘露醇，100 mmol/L CaCl2），轻轻弹匀后静置20 min进行诱导。将混合物用W5溶液清洗2次，最后加入1.0 ml W5溶液置于室温、弱光下培养15 h后收集备用。

1.2.5激光共聚焦显微镜观测。瞬时转化ABP9∷GFP融合载体的原生质体培养过夜后，用4′，6二脒基2苯基吲哚（DAPI）进行细胞核染色（DAPI储存液与工作液按1∶1 000稀释，最终浓度100 ng/ml），染色1 h后用ZEISS激光共聚焦显微镜LSM700观测荧光分布。

1.2.6玉米原生质体总RNA提取及反转录PCR。将收集好的原生质体，按照Trizol Reagent说明书提取总RNA，并用1.2%的琼脂凝胶电泳检测RNA的完整性，将完整性较好的RNA放于-80 ℃低温冰箱中备用。将上述提取的原生质体总RNA参照TransScript OneStep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行反转录，用在线引物设计软件（http：//www.yeastgenome.org/cgibin/webprimer）设计反转录PCR的引物，引物的上下游序列分别为ABP9genomicpureFW：5′ATGGCGTCGGAGACCACC3′和3FlagpureRV：5′ TCACTTATCGTCATCGTC3′。以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物；同时以pUC1935SABP9genomic3FlagTnos为模板，用相同的引物进行PCR作为检测ABP9在玉米原生质体中转录的对照。

1.2.7 Western blot检测ABP9的表达。分别取100 g未转化和转化pUC1935SABP9genomic3FlagTnos的原生质体，加入蛋白提取液（50 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl，1% TritonX100，100 μg/ml PMSF）后用移液器吸打，加入上样缓冲液[50 mmol/L Tris·Cl（pH 6.8），100 mmol/L DTT，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油]，高温变性5 min，经12% SDSPAGE电泳，转至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上，用磷酸盐吐温缓冲液（PBST）（137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，0.1%Tween20）溶液洗膜，并用含有5%牛奶的PBST室温下摇动封闭2 h。滴加抗鼠Flag一抗（1∶5 000）孵育，4 ℃过夜；再次用PBST洗，洗完后加HRP标记的羊抗鼠二抗（1∶5 000）孵育30 min后，PBST洗涤。结果用ECL化学发光显色分析，并用x-胶片进行显影。

2结果与分析

2.1亚细胞定位载体及瞬时表达目的基因载体的构建用于亚细胞定位的载体ABP9∷GFP融合表达载体及瞬时表达ABP9基因载体pUC1935SABP9genomic3FlagTnos通过菌落PCR初步检测后，酶切筛选阳性克隆，并将阳性克隆进行测序，测序结果经序列比对软件分析，结果表明插入片段与预期序列完全一致，如图1所示，表明载体构建成功。

注：a为pCAMBIA130335SABP9GFPTnos载体；b为pUC1935SABP9 genomic3FlagTnos载体。

图1亚细胞定位载体及瞬时表达目的基因载体构建安徽农业科学2014年2.2 PEG介导的玉米原生质体的转化该研究借鉴拟南芥叶肉瞬时表达系统标准方法[22]并进行改进，将诱导剂PEGCa2+的浓度由40%降低到30%，选用暗培养的玉米Qi319两叶期幼苗为材料，在转速为30 r/min的水平摇床上酶解7 h，可获得活力达90%左右的玉米叶肉原生质体。为了提高玉米叶肉原生质体转化ABP9的效率，对质粒浓度和培养时间等条件进行摸索，综合原生质体活力及转化效率考虑，最终得到每管反应体系转化10 μg质粒，培养15 h，可以使转ABP9原生质体的转化效率达50%。

2.3ABP9亚细胞定位分析将构建的亚细胞定位载体pCAMBIA130335SABP9GFPTnos转化玉米叶肉原生质体，经过DAPI细胞核染色后，用激光共聚焦显微镜观察瞬时表达ABP9∷GFP融合载体的原生质体内荧光分布。如图2所示，ABP9∷GFP蛋白只出现在细胞核中，由此证明ABP9蛋白定位于细胞核。玉米中，过氧化氢酶基因（CAT）编码3种同工异构酶CAT1、CAT2和CAT3，共同催化H2O2分解，由此在ROS清除酶系统中占主要部分。ABA应答元件ABRE2位于Cat1的启动子上，主要参与ABA诱导的Cat1的表达[9-10]。玉米抗逆转录因子ABP9是与ABRE2互作从而激活下游报告基因的表达的反式作用因子。该亚细胞定位的结果符合反式作用因子作用特点，证实了ABP9蛋白的核定位调控。

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