鲤春血症病毒单克隆抗体建立及免疫学特性鉴定

景宏丽 张 旻 王 娜 李 维 贾小波 方 莹 高隆英 林祥梅 吴绍强*

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100029；2.蛇口出入境检验检疫局）

1 前言

鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp，SVC）是一种由弹状病毒感染，能够引起数种鲤鱼、鲤科鱼类以及鲶科鱼类急性出血和流行性败血症，春季SVC爆发时，幼龄鲤鱼的死亡率可达70%。在奥地利、法国、德国、英国[1]、加拿大[2]和北美[3]等多个国家和地区均有SVC的相关报道，我国于2004年也首次报道了SVC[4]，目前该病已被世界动物卫生组织（OIE）列为必须申报的疫病[5]。SVC的病原是鲤春血症病毒（Spring Viraemia of Carp virus ,SVCV），属弹状病毒科，暂被列入水疱病毒属。该病毒基因组为不分节、负意义的单链RNA；基因组包含有11019个核苷酸，依次编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）、依赖RNA的RNA聚合酶（L）[6]。目前检测该病毒的常用方法是先进行病毒分离，然后用RT-PCR技术[7-9]或者其他方法[10-11]进行鉴定。RT-PCR技术虽然具有高灵敏度的优越性，但在结果判断上易出现假阳性。OIE还推荐了一些检测方法，即建立在单克隆抗体基础上的间接免疫荧光技术（IF）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。近年来，一些学者建立了诊断SVC的商业试剂盒，主要是采用IF和ELISA两种方法检测几种弹状病毒，包括SVCV的几种不同株。ELISA结果显示试剂盒的特异性较差，而IF仅能检测出4株SVCV中的一株[12]。为了提高抗体的特异性，有些学者也应用了单克隆抗体技术。如2007年，邴国霞等制备了针对SVCV核蛋白的单克隆抗体[13]；国外学者S.Reschova等制备出了抗SVCV的G蛋白的单克隆抗体，但与另外一种弹状病毒PFR有交叉反应[14]。本研究旨在制备特异性强的抗SVCV单克隆抗体，以期研制有效的病毒鉴定方法，满足我国水生动物检疫工作的迫切之需。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试剂

RPMI 1640：购于HyClone公司；特级胎牛血清：购于杭州四季青公司；HAT、HT、聚乙二醇（PEG1500）：均购于Gibco公司；二甲基亚砜、硫酸盐TMB、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG、弗氏完全佐剂和不完全佐剂：均购于Sigma公司；DAB发色液：购于天根公司；硝酸纤维素膜：购于PALL公司；SBA抗体分型试剂盒：美国 Shouthern Biotech生产；其他试剂：均为国产分析纯。

2.1.2 仪器

TS100倒置相差显微镜：Nikon公司；二氧化碳培养箱：SANYO公司；Avanti J-30I超速离心机：Beckman公司。

2.1.3 实验动物及其他材料

SP2/0细胞、实验中涉及的鱼类细胞株和病毒株：均由本实验室保存；BALB/c小鼠：购于北京军事科学与医学研究院。

2.2 方法

2.2.1 抗原的制备和免疫小鼠

SVCV经由EPC细胞在20℃扩增，冻融一次后收集病毒悬液，经过7000g 离心35 min，收集上清液，75000g差速离心5h，收集沉淀，用0.5mL的生理盐水重悬。

免疫BALB/c小鼠，共免疫4次。具体免疫程序如下：①基础免疫。病毒悬液与弗氏完全佐剂1:1混合，按每只0.1mL腹腔注射；②2周后加强免疫。病毒悬液与弗氏不完全佐剂1:1混合，每只腹腔注射0.1mL；③之后每隔1周再按同样剂量腹腔注射加强免疫1次；④第4次免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。

2.2.2 细胞融合

采用常规方法进行细胞融合[15]：取免疫小鼠的脾脏细胞和Sp2/0细胞混合于融合管内，100g离心5 min，弃上清液，轻振管底，使沉淀细胞松散均匀，置于37℃水浴中预热；用60 s时间缓慢加入1mL PEG1500溶液，边加边轻转搅拌，然后缓慢加入改良型RPMI1640培养基，终止融合；70g离心6 min，弃上清液，加入HAT培养基；再加入适量的饲养细胞分装至96孔细胞培养板，于45mL/L CO2培养箱中培养。

2.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选

当杂交瘤细胞群落长到占培养板孔底1/3时，取细胞培养液上清液进行检测。使用经过差速离心初步提纯、浓缩的SVCV悬液包埋96孔ELISA板，抗原的包被浓度为4μg/mL，阴性对照为正常的细胞悬液，包被条件为4℃过夜；加入待测的杂交瘤细胞培养上清液，并37℃反应90min后，洗涤，随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG，洗涤；TMB发色液发色，2 mol/L H2SO4终止反应；测定波长为450 nm时各孔的OD值(A450)，计算待测上清与病毒孔和细胞孔反应后的OD值之比（P/N），当P/N≥2.1时判定为阳性。

2.2.4 阳性杂交瘤细胞系的建立与腹水的制备

将检测结果为阳性的杂交瘤细胞孔中的细胞扩大培养并及时冻存，同时按照有限稀释法进行克隆，至阳性率为100%时，即可定株。然后，进行腹水的诱生，主要是取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按每只0.5mL腹腔内注射无菌的液体石蜡；1周后，每只腹腔内注射106个活的阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7-10 d，小鼠腹部明显膨大；用酒精棉球消毒下腹部皮肤后，用注射器抽取腹水。一般每只小鼠1 次可抽腹水1-5mL，间隔2-3 d，待腹水再生积蓄后，同法再抽，一般可抽1-3次。2000g离心10 min，收集水相上清液（不能吸取离心管最上层的油相物质），-20℃冻存备用。

2.3 单克隆抗体免疫学特性的鉴定

2.3.1 mAb效价测定

用间接ELISA方法测定。收集的腹水2倍比系列稀释，其测定步骤同2.2.3。

2.3.2 mAb的亚型分析

按照SBA抗体分型试剂盒使用说明书进行测定。

2.3.3 mAb特异性测定

选取5种不同病毒和8种细胞株作为抗原包埋ELISA板，以测定所制备的抗SVCV腹水与它们的交叉反应程度。

2.3.4 SDS-PAGE 和Western blot分析

获得的mAb分别与差速离心纯化的SVCV和EPC细胞裂解液进行免疫印迹实验，以分析抗体所识别的抗原表位。按照文献常规方法[15]进行SDS-PAGE和Western blot分析，浓缩胶浓度为50g/L，分离胶浓度为120g/L；SDS-PAGE后，电转印到硝酸纤维膜上，用100/L脱脂奶粉4℃封闭过夜；洗涤后，加入腹水抗体（1:1500），37℃孵育1h；再次洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（1:10000），37℃孵育1 h；经过洗涤后，DAB显色。

2.3.5 免疫过氧化酶染色

接种EPC细胞到24孔板上，待细胞长满单层后，每孔加入100μL SVCV；35h后用固定液（30%丙酮和70%的酒精混合液）固定15min，加入单克隆抗体9C11（1:1000），37℃孵育90min；PBS-T洗涤3次，加入过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠抗体IgG（1:200），37℃孵育90min后，洗涤3次；DAB发色。显微镜下观察。

3 结果

3.1 杂交瘤细胞株的建立

细胞融合后，经含HAT的培养基进行筛选，产生200多个杂交瘤细胞；经间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体，筛选出抗SVCV的阳性细胞株进行克隆，获得2株能稳定分泌抗SVCV mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为9C11和1C12。

3.2 单克隆抗体免疫学特性的鉴定

3.2.1 效价和亚型分析

间接ELISA法测得腹水的效价为104以上；抗体分型试剂盒检测结果显示所分泌的抗体亚型属于Ig2b型，k链。

3.2.2 mAb的特异性测定

按照2.2.3节用ELISA方法把mAbs 9C11和1C12 分别与病毒性出血性败血症病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)、鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）、传染性造血组织器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、狗鱼幼鱼弹状病毒（pike fry rhabdovirus，PFRV)、草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp reovirus，GCRV）和流行性造血器官坏死病毒（epizootic haematopoietic necrosis virus,EHNV）以及8种鱼类细胞株反应，结果见表1。结果显示：mAb 9C11和1C12均仅与SVCV反应，与其他的病毒株和细胞株均不发生反应。

表1 mAb 9C11和1C12与病毒及细胞的ELISA反应结果（P/N值）

3.2.3 SDS-PAEG 和Western blot检测

对mAbs抗原识别表位的初步分析结果表明：单抗对应的抗原决定簇位点位于SVCV相对分子质量（Mr）230 000的蛋白带上（见图1）。

图1 SDS-PAGE和Western blot检测结果

3.2.4 免疫过氧化酶染色

经鉴定SVCV接种鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）35h后，局部细胞出现深褐色，正常细胞未呈现颜色或仅显很浅的本底色，如图2箭头标示。A为低倍镜下结果，B为高倍镜下结果。

图2 免疫过氧化酶染色

4 讨论

免疫原是产生抗体的先决条件，故需选择合适的方法和反应条件来制备免疫原。应用前人的蔗糖梯度离心的方法制备病毒抗原，虽然保证了病毒的纯度，但是制备过程比较繁琐，且含量比较低。在抗原的制备上，本研究选择差速离心法，操作方便；在免疫方法上，采用免疫抑制的方法，弥补了病毒抗原制备上纯度低的缺陷，保证了免疫效果。本实验室在其他病毒抗体研制过程中也采用了类似的方法，取得了较好的免疫效果，但是具体机体对抗原产生耐受的机制或者原理还有待进一步的证实。

单克隆抗体对比多克隆抗体最主要的优势是特异性高，本研究制备的抗SVCV的mAbs仅与SVCV反应，与其他鱼类细胞和鱼类病毒株均不反应。说明该mAbs具有较高的特异性。对比国内外的其他学者的研究，本研究较全面地分析mAbs的特异性，无疑为mAbs的应用和SVCV免疫学检测方法的建立提供重要的理论基础。另外，免疫过氧化酶染色实验结果表明mAbs能够特异性的检测到细胞中的病毒，为后期免疫学方法的建立提供了坚实的基础，也为后期进一步研究病毒在宿主中的复制机制和过程提供了可能。

5 结论

本研究成功制备了抗SVCV的单克隆抗体，该抗体腹水效价均在104以上，且特异性高，与其他的病毒株和细胞株均没有交叉反应，今后可为该病毒的快速诊断及流行病学监测提供检测试剂。

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