慢性乙型肝炎患者肝组织基质金属蛋白酶组织抑制物-1表达及其意义*

朱传龙，李毓雯，李文庭，李宜，高人焘

·慢性乙型和丙型肝炎·

慢性乙型肝炎患者肝组织基质金属蛋白酶组织抑制物-1表达及其意义*

朱传龙，李毓雯，李文庭，李宜，高人焘

目的分析慢性乙型肝炎患者血清和肝组织基质金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）表达水平与肝纤维化分期的相关性。方法分别采用免疫组化法和双抗体夹心酶联免疫吸附法检测患者肝组织和血清TIMP-1表达水平，分析两者相关性；对159例慢性乙型肝炎患者行肝活检病理学检查，以组织学活动指数（HAI）予以分级（G）和分期（S），分析慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平与HAI分级和纤维化分期的相关性。结果慢性乙型肝炎患者肝组织TIMP-1表达水平与其血清水平呈显著性正相关（r=0.9521，P＜0.01）；不同肝纤维化分期（S1～S4）慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差异显著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平与肝纤维化分期呈正相关（r=0.704，P＜0.01），但不同炎症分级的慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差异无显著性。结论血清TIMP-1水平可以较好地反应肝脏纤维化程度，且不受肝组织炎症分级的影响，有望被用于肝组织纤维化程度的临床无创评估。

慢性乙型肝炎；基质金属蛋白酶组织抑制物-1；肝纤维化；炎症

乙型肝炎肝硬化患者肝组织病理学变化的基础是肝纤维化。肝组织活检是目前诊断肝纤维化的金指标，但因其具有创伤性，容易发生出血和疼痛等并发症而限制了其临床应用。临床常用的血清学指标如透明质酸（HA）、层粘蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）等因与肝组织的炎症坏死程度关系密切，其血清水平往往受到肝脏炎症的影响，给临床上正确评估肝纤维化的程度带来一定的困难。近年来，研究发现丙型肝炎患者血清基质金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）水平与肝组织纤维化程度呈正相关[1，2]。然而，在慢性乙型肝炎患者，两者的相关性问题尚不

明确。本研究检测了慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平和肝组织TIMP-1表达水平，以探讨血清TIMP-1水平诊断肝纤维化分期的可能性。

1 材料与方法

1.1 研究对象2007年12月～2009年10月在解放军第123医院和我院确诊的慢性乙型肝炎患者159例，男性113例，女性46例；年龄为18～62岁，平均年龄（42.0±6.5）岁。按照慢性乙型肝炎防治指南（2010版）的诊断标准[3]诊断，排除慢性肾、肺和心脏疾病。另选同期健康献血员10例，男性7例，女性3例；平均年龄（32.0±8.4）岁。所有研究对象均签署知情同意书，本研究在安徽省立医院伦理委员会备案。

1.2 血清TIMP-1水平检测采用双抗体夹心ELISA法，抗TIMP-1单克隆抗体（McAb）购自美国Santa Cruz公司。操作步骤如下：以0.05 M碳酸盐缓冲液（pH 9.6）为包被液，将稀释成一定浓度的抗TIMP-1单克隆抗体分别滴加在96孔聚苯乙烯板微孔内，每孔100 μl，4 ℃过夜，次日甩尽包被液，用0.05%（v/v）Tween-20 PBS（PBST）洗板3次，每次3 min，拍干后加封闭液（含15%小牛血清的PBS）200 μl/孔，37℃1 h，4 ℃过夜，次日弃之，PBST洗涤3次，每次3 min；将标准品及待测血清（待测样品用PBS作1∶100稀释）加于包被孔内，并设阴性对照、空白对照，37℃水浴1 h，PBST洗板5次，拍干后加HRP2抗TIMP-1 100μl/孔，37℃30 min，PBST洗板5次，彻底拍干后加入TMB显色剂，50 μl/孔，37℃15 min，加2M H2SO450μl/孔，终止反应；在酶标仪（Elx800型，BIO-TEKINSTRUMENTS.INC）450 nm处测量吸光度A值（OD值，以空白对照孔调零），通过标准曲线查得待测血清TIMP-1水平。

1.3 肝组织病理学检查采用负压针吸肝活检，肝组织长度为＞1.5 cm，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，行连续切片，常规HE、网状纤维和Masson染色。由解放军第123医院病理科做出组织学诊断，其中G2S0～4患者48例，G0～4S2患者41例。

1.4 肝组织TIMP-1检测采用SP法（免疫组化试剂盒SP-9001购自北京中杉金桥生物技术有限公司），石蜡切片4 μm，常规脱蜡至水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，微波加热暴露抗原，滴加兔源TIMP-1多克隆抗体（购自武汉博士德公司），1∶100稀释，4 ℃冰箱过夜，PBS洗片后滴加羊抗兔二抗（1∶500），37℃孵育1 h，DAB显色，控制在3～5 min，复染、脱水、透明、封片。显色强度经HPIAS-1000病理图文报告分析系统（武汉千屏影像技术有限责任公司）进行定量分析。每张切片随机取10个视野，计算肝组织TIMP-1表达的阳性密度值。

1.5 统计学方法采用SPSS11.5软件进行统计学处理，测定值用（±s）表示，采用t检验及直线相关分析，组间均数的比较采用方差分析，P＜0.05表示有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 血清TIMP-1水平与肝组织TIMP-1表达水平的相关性在16例慢性乙型肝炎患者，同时检测肝组织TIMP-1表达和检测血清TIMP-1水平，结果显示肝组织TIMP-1表达与血清水平之间呈显著性正相关。直线回归方程为：Y=1.078X+16.55（r=0.9521，P＜0.01，图1）。

图1 慢性乙型肝炎患者肝组织TIMP-1表达与血清TIMP-1水平的相关性

2.2 血清TIMP-1水平与肝组织纤维化分期之间的关系选择本组G2S08例、G2S110例、G2S215例、G2S39例和G2S46例。检测他们血清TIMP-1水平发现，随着肝纤维化程度的加重，血清TIMP-1水平逐步升高，其中G2S1与G2S2组、G2S2与G2S3组和G2S3与G2S4组之间相比，差异显著（P＜0.01）。血清TIMP-1水平与肝组织纤维化分期之间呈显著性正相关（r=0.704，P＜0.01，图2）。

图2 不同肝组织纤维化分期慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比较

2.3 血清TIMP-1水平与炎症活动度分级之间的关系从159例慢性乙型肝炎患者中筛选出G0～4S2患者41例，其中G1S2组12例、G2S2组15例和G3S2组14例。取患者外周血清，采用ELISA法检测TIMP-1水平。结果显示：G1S2与G2S2组、G1S2与G3S2组、G2S2与G3S2组之间相比，血清TIMP-1水平均无显著性差异（P＞0.05，图3）。

图3 不同炎症活动度分级慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比较

3 讨论

自1995年中华医学会传染病学与寄生虫病学学会、2000年中华医学会传染病学与寄生虫病学会和中华医学会肝脏病学学会联合制定的《病毒性肝炎防治方案》把血清HA、PCⅢ、CⅣ和LN水平作为诊断肝纤维化的指标以来，由于病例选择、检测方法、检测试剂等方面的差异，在应用血清标志物诊断肝组织炎症坏死活动度和肝纤维化的程度方面结果常不一致。因为血清HA、PCⅢ、CⅣ和LN不仅与纤维化程度有关，而且与肝组织的炎症坏死程度也可能关系密切，给临床上正确评估肝纤维化的程度带来一定的困难，其对肝纤维化的诊断仅起到临床参考作用。在2003年，Rosenberg et al指出急需建立一种可靠的、重复性高的非创伤性监测肝纤维化的指标，最好是一种血清学标志物,说明了血清学诊断肝纤维化的重要性[4，5]。

有关细胞外基质（ECM）的研究发展迅速，在正常肝脏的纤维组织中存在着ECM生成与降解的动态平衡，肝纤维化是ECM生成与降解过程失衡的结果。既往对ECM的生成与沉积研究较多，近年开始对ECM降解的研究亦日益深入。在ECM降解过程中，基质金属蛋白酶及其抑制物的平衡起着至关重要的作用。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组能降解细胞外基质成分的重要蛋白分解酶，MMPs是一组锌酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，并能使MMPs家族其它成员相继激活，形成瀑布效应。人体已发现的MMP有20种，按照作用底物不同，MMP可分为4类，即间质胶原酶、基质溶解素、明胶酶和膜型金属蛋白酶[6～8]。TIMPs是一组具有抑制MMPs功能的活性多肽，他们在ECM代谢的调节中起着非常重要的作用。TIMPs在肝脏中来源主要为HSC、Kupffer细胞，以及少量来源于肝细胞。TIMPs是组织中MMPs主要的内源性抑制因子，受许多参与MMP基因调控的细胞因子和生长因子的同步调控，现已发现四种TIMP，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，它们对目前已知的MMPs均具有抑制作用[9～11]。大量研究已经证实，TIMP-1、TIMP-2在肝组织的过度表达与肝纤维化的形成密切相关[1，12～14]。除此之外，TIMPs家族在心、肺、肾等多种脏器的纤维化病程中也发挥至关重要的作用。Heymans S et al通过对36例主动脉狭窄患者心肌标本检测发现，心肌细胞TIMP-1、TIMP-2的高表达与心肌组织纤维化和功能障碍的发生密切相关，说明TIMPs也是导致心室扩大和心肌重构的主要因素之一。因此，该基因在今后可能作为主动脉狭窄患者潜在的治疗靶点[15]。同样，MMPs和TIMPs的比例失调在肺纤维化胶原代谢紊乱中起重要作用，肺组织TIMP-1和TIMP-2活性的升高可以抑制MMP-9和MMP-2活性，影响肺组织正常的修复和胶原降解，从而发生肺组织纤维化[16～18]。另外，现已发现的4种TIMPs均能在肾组织表达。大量研究表明，TIMPs在慢性肾脏病发生发展中起着不可替代的作用，其中TIMP-1的过度表达是导致肾间质纤维化的主要原因之一[19，20]。

综上所述，TIMPs在心、肝、肺和肾脏纤维化发生机制中起重要作用，血清TIMPs（主要为TIMP-1、2）水平升高，能使MMPs活性下降，引起组织ECM积聚，促使发生纤维化。因此，目前认为血清TIMP-1和TIMP-2水平可以反映多种脏器纤维化的程度。然而，通过检测血清TIMPs水平评估慢性肝病患者纤维化程度可能受到其他脏器组织异常分泌TIMPs水平的影响，从而影响TIMPs作为诊断肝纤维化血清指标的特异性。因此，现有的大部分临床研究资料均显示，TIMPs作为肝纤维化诊断血清学指标，其检测的特异性相对较差[21]。

本研究中，为评估TIMP-1与慢性乙型肝炎肝纤维化的关系，所选研究对象均排除了合并有慢性心脏、肾脏和肺疾病，以及其他原因所致的慢性肝病。我们对慢性乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化染色发现，随着肝纤维化程度的加重，TIMP-1在肝脏的表达量逐步升高，主要表现在肝组织间质细胞和部分肝细胞的阳性表达的增多。对肝组织TIMP-1表达水平进一步行半定量分析并与血清水平相比较，发现组织TIMP-1与血清水平之间具有显著性正相关，说明在慢性乙型肝炎患者，血清TIMP-1水平可以很好地反映肝脏TIMP-1表达水平。因此，在今后的临床工作中，如果能排除慢性乙型肝炎患者合并有其他脏器的纤维化疾患，血清TIMP-1水平的检测可以代替患者肝组织TIMP-1表达的检测，从而避免不必要的肝活检。

在本研究中，我们对159例慢性乙型肝炎患者进行肝活检，并予以肝组织病理学检查。结果肝组织炎症分级为G2的慢性乙型肝炎患者48例，其中G0期8例、G1期10例、G2期15例、G3期9例和G4期6例；肝组织纤维化分期为S2的慢性乙型肝炎患者41例，其中S1级12例、S2级15例和S3级14例。对肝组织炎症G2级患者进行血清TIMP-1检测，结果显示随着肝纤维化程度的加重，慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平逐步升高，G2S1、G2S2、G2S3和G2S4四组之间TIMP-1水平相比差异显著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平与肝组织纤维化分期之间呈显著性正相关。对41例肝组织纤维化S2期患者进行血清TIMP-1水平检测，结果显示G1S2、G2S2和G3S2组之间TIMP-1水平相比无显著性差异（P＞0.05）。以上研究结果提示，血清TIMP-1水平与肝组织纤维化分期具有很好的相关性，可以反映肝组织的纤维化程度，且不受肝组织炎症程度的影响。故在临床上可综合考虑及动态监测，以更好更准确地判断慢性乙型肝炎患者肝纤维化病程的进展趋势。

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（收稿：2013-11-29）

（校对：陈从新）

Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in livers of patients with chronic hepatitis B

Zhu Chuanlong，Li Yuwen，Li Wenting，et al.Department of Infectious Disease，Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，Anhui Province，China

Objective To evaluate the expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-1（TIMP-1）in livers of patients with chronic hepatitis B（CHB）and to explore the potential relationship between TIMP-1 level and hepatic fibrosis progression.Methods The tissue and serum levels of TIMP-1 were determined by immunohistochemistry and double-antibody sandwich enzyme-linked immunoadsorbent assay，respectively，and their correlation was determined.One hundred and fifty-nine patients with CHB underwent liver biopsy and their liver histological activity index（HAI）and fibrosis（S）were determined.The correlation between the serum TIMP-1 levels and HAI grading and staging was analyzed.Results The expression of TIMP-1 in liver tissues were positively correlated to serum TIMP-1 levels in CHB patients（r=0.9521，P<0.01）；Serum TIMP-1 levels were significant different among patients with different liver fibrosis stages（S1to S4）（P<0.05），and a positive correlation between serum TIMP-1 level and hepatic fibrosis staging was found（r=0.704，P<0.01）；However，there were no significant differences in serum TIMP-1 levels among patients with different liver inflammatory grades.Conclusions Serum TIMP-1 level is not affected by liver inflammatory grades and is promising in non-invasive clinical evaluation of liver fibrosis.

Chronic hepatitis B；Tissue inhibitor of metalloproteinases-1；Hepatic fibrosis；Inflammation

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.007

国家自然科学基金资助项目（81271713）；安徽省第五批优秀青年科技基金滚动支持项目（1308085JGD09）；安徽医科大学校长基金资助项目（2011xkj074）

230001 合肥市安徽医科大学附属省立医院感染病科（朱传龙，李文庭，李宜，高人焘）；儿内科（李毓雯）

朱传龙，男，33岁，医学博士，副主任医师。主要从事病毒性肝炎的基础与临床研究

高人焘，E-mail：rentaogao@sohu.com