740例HBV感染者血清HBV逆转录酶区耐药位点分析*

戴明佳，方圆，汪莉萍，武桂萍，石银月，颜学兵

740例HBV感染者血清HBV逆转录酶区耐药位点分析*

戴明佳，方圆，汪莉萍，武桂萍，石银月，颜学兵

目的了解乙型肝炎病毒（HBV）感染者HBV基因型的构成状况及HBV P区基因变异的特点。方法对2010年8月～2011年10月送检的740份HBV感染者血清，采用ABI基因测序仪检测HBV耐药位点和基因型，应用SPSS15.0软件进行统计分析。结果在740例HBV感染者中，检出HBV B基因型40例（5.41%），C基因型695例（93.92%），D基因型5例（0.68%）；与拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦耐药明确相关的位点突变377例（50.95%），其中195例（51.72%）患者既往有明确的应用核苷（酸）类似物（NA）史，在这195例发生耐药的患者中，B基因型12例，C基因型183例，两基因型间耐药发生率无明显差异，他们中包括CHB患者118例，肝硬化患者77例，主要耐药变异模式为M204V+L180M、M204I、M204I+L180M和A181V，两组间ALT、HBV DNA载量和主要耐药变异模式检出率均无统计学差异；HBV DNA载量是影响NA耐药的相关因素（x2=0.496，P＜0.001），但耐药与年龄、性别、疾病严重程度（CHB或肝硬化）和ALT水平无显著性相关；此外，本文还检出多处未知变异位点，如rt64、rt126、rt178和rt129等。结论核苷（酸）类似物的使用将伴随病毒变异的发生，其耐药基因变异位点具有一定的特点及规律性，动态监测HBV DNA载量对早期发现耐药有一定的价值。

乙型肝炎；突变；核苷（酸）类似物；耐药

1 资料与方法

1.1 病例选择740例患者均为2010年8月～2011年10月在我科住院和门诊收治的HBV感染者。所有病例诊断均符合2005年发布的《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[3]。其中CHB患者432例，男性340例，女性92例；平均年龄（33.2±9.4）岁。乙型肝炎肝硬化（Liver cirrhosis，LC）患者308例，男性262例，女性46例；平均年龄（42.8±10.6）岁。所有患者均排除其他嗜肝病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪肝、药物性肝损伤和遗传代谢性肝病等。

1.2 检测方法采用速率法检测ALT（美国Abbott公司）；采用荧光定量PCR法检测HBV DNA（上海科华生物工程股份有限公司，最低下限1000copies/ml）；采用毛细管电泳测序法检测HBV基因型和耐药变异（上海申友生物技术有限责任公司）。

1.3 统计学处理采用SPSS16.0 统计软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，对各组HBV DNA水平行方差齐性检验，然后应用SNK法检验并进行两两比较，检验水准为α=0.05。率的比较采用x2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型检测情况在740例HBV感染者中，检出HBV B基因型40例（5.41%），C基因型695例（93.92%），D基因型5例（0.68%）。

2.2 已知耐药位点的变异模式在740例HBV感染者中，检出与拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil，ADV）和恩替卡韦（Entecavir，ETV）耐药明确相关的位点突变377例（50.95%），其中195例患者既往有明确的应用NA史，包括B基因型12例，C基因型183例，两基因型间耐药发生率无明显差异（P＞0.05）。在195例发生耐药的患者中，CHB患者118例，LC患者77例，CHB和LC患者耐药检出率无统计学差异（x2=0.496，P＞0.05）。另182例发生耐药的患者因既往用药史不清楚，未进一步分析。

在118例CHB患者中，单用LAM耐药突变77例，检出3个耐药突变位点（M204V/I、L180M、A181T），呈7种突变模式，以M204I/V+L180M、M204I、M204I多见；单用ADV耐药突变13例，检出2个耐药突变位点（A181V/T、N236T），呈5种突变模式，以A181V多见；与LAM和ADV联合/序贯治疗相关的耐药突变11例，检出5个耐药突变位点（A181V/T、N236T、L180M、M204V/I、V173L），呈7种突变模式，其中以L180M+M204V+V173L多见。在9例LAM耐药后加用ADV的患者中，检出4个耐药突变位点（L180M、M204V/I、A181T、N236T），呈4种突变模式，以M204I+L180M居多；LAM与ETV序贯治疗患者8例，检出3个耐药突变位点（L180M、M204V/I、S202G），呈3种突变模式，分别为M204V+L180M、M204I+L180M+S202G、M204V+L180M+S202G（表1）。

表1 118例CHB患者经核苷（酸）类似物治疗后病毒基因耐药变异模式

在77例LC患者中，单用LAM耐药突变57例，检出4个耐药突变位点（M204V/I、L180M、A181T/V、V173L），呈7种突变模式，仍以M204I/V+L180M、M204I、M204I多见；单用ADV耐药突变8例，检出2个耐药突变位点（A181V/T、N236T），呈4种突变模式，也以A181V多见；与LAM和ADV联合/序贯治疗相关的耐药突变5例，检出4个耐药突变位点（A181V/T、L180M、M204V、V173L），呈3种突变模式，其中以A181T多见。在3例LAM耐药后加用ADV的患者中，检出3个耐药突变位点（L180M、M204I、A181T），呈2种突变模式，其中1例为A181T，2例为M204I+L180M突变；LAM与ETV序贯治疗患者4例，检出4个耐药突变位点（L180M、M204V/I、V173L、S202G），呈3种突变模式，分别为M204V+L180M、M204I+L180M+V173L、M204V+L180M+S202G（表2）。

表2 77例LC患者经核苷（酸）类似物治疗后病毒基因耐药变异模式

2.3 不同耐药变异患者血清ALT和HBV DNA水平比较在CHB和LC患者中，耐药发生频率最高的变异模式分别为：M204V+L180M、M204I、M204I+L180M和A181V等四组，各组ALT和HBV DNA水平比较无统计学差异。CHB和LC患者主要耐药变异模式发生频率比较也无统计学意义（P＜0.05），见表3和表4。

表3 不同耐药变异CHB患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比较

表3 不同耐药变异CHB患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比较

变异模式例数ALT（U/L）HBV DNA（log10 copies/ml）M204V+L180M4252.67±36.775.67±1.32 M204I1658.38±34.825.78±1.72 M204I+L180M1453.15±23.295.48±1.44 A181V657.37±32.075.51±0.70

表4 不同耐药变异LC患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比较

表4 不同耐药变异LC患者血清ALT和HBV DNA水平（±s）比较

变异模式例数ALT（U/L）HBV DNA（log10 copies/ml）M204V+L180M2555.56±41.095.71±1.01 M204I1562.29±34.825.67±1.38 M204I+L180M1056.45±31.175.39±1.04 A181V460.41±38.135.13±0.83

2.4 耐药相关因素分析在740例HBV感染者中，除外发生耐药的377例（其中195例有明确的NA用药史）外，另363例患者为应用NA治疗但未发现已知耐药相关位点，其中282例患者有完整的临床资料。我们将195例应用NA且发生耐药患者及282例应用NA未发生耐药患者纳入耐药因素统计分析。将患者的年龄、性别、疾病分期、ALT水平、HBV DNA水平及服用NA种类作为耐药相关因素进行单因素方差分析，结果发现HBV DNA水平是影响NA耐药的相关因素（表5）。

表5 影响病毒基因耐药的单因素分析

2.5 其他变异位点在740例耐药基因检测中，发现了一些未见文献报道或未经体外实验证实与NA耐药相关的位点变异。其中出现频率较高的变异位点分别为P64V/I 52例（7.03%），F178L/V 33例（4.46%），K154F/Y 31例（4.19%）。这些变异位点可以单独出现，也可以与已知耐药变异位点同时存在。目前尚未有文献报道它们与NA耐药具有明确相关性。

3 讨论

在本研究中，发生NA耐药的患者比例为LAM＞ADV＞ETV。LAM的耐药突变位点临床多见的主要是rtM204V/I和（或）rtL180M等，其中rtM204V/I又称为YMDD变异，以rtM204I更为多见。有文献报道YMDD的发生率可能与HBeAg和HBV DNA水平相关[4，5]。ADV耐药变异较LAM少见，公认的耐药相关变异位点是rtN236T和rtA181V/T。rtN236T不会显著影响病毒对LAM的敏感性，但rtA181T/V突变株可与LAM发生部分交叉耐药。此外，尚有报道rtQ215S/P/H、rtV214A、rtN238H、rtI233V、rtN118H、rtM207V、rtA200V和rtL180M等位点变异与HBV对ADV耐药相关，这些变异位点被定义为继发耐药变异位点，但其重要性尚需进一步明确[6～8]。本研究发现8例rtQ215P/H/L位点变异患者，均对ADV耐药。rtV214A变异22例，其中21例对ADV耐药。因样本量较小，这些变异位点与ADV的相关性仍需大规模临床试验研究及体外表型分析证实。

在134例单一应用LAM抗病毒治疗的患者中，出现了3例rtA181T变异，1例rtA181V变异（伴随rtV207I变异）。既往认为rtA181V只在接受ADV治疗的患者中出现，但有研究显示，此变异也可以在单一接受LAM治疗的患者中出现，且181位点单一氨基酸改变即可能导致LAM和ADV交叉耐药[9，10]。比起只接受单一NA治疗的患者，rtA181多位点突变在有多种NA应用史的患者中出现得更为频繁。

ETV耐药基因屏障较高，至少有3个位点的碱基置换才能产生耐药，即rtM204V和rtL180M，再加上rtT184、rtS202和（或）rtM250中的任一位点。本文共检出16例ETV基因型耐药，变异组合模式主要为rtM204V+rtL180M+rtS202G/H（8/16）。ETV在NA初治患者中的耐药发生率很低，最初只在对LAM耐药的病人中出现。有研究显示应用ETV 3年累积耐药率仅为1.7%～3.3%[11]，但有LAM治疗失败史的患者其耐药发生率明显增高，已证实rtM204V/I会降低对ETV的敏感性[12，13]。对于ETV治疗失败的患者，目前尚未达成统一的共识和规定，现主要主张为：1）换用ADV；2）LAM联合ADV；3）IFN-α；4）替诺福韦[14]。

有文献报道，接受NA治疗的HBV感染者，其HBV DNA水平是发生耐药的独立危险因素，耐药不只与基线HBV DNA水平有关，也与治疗过程中的动态变化密切相关[15]。本研究结果与之相符。故在临床中，密切监测HBV DNA水平变化，可及早发现产生耐药的HBV感染者，有利于早期干预治疗。

此外，我们在实验中共发现了82个新的变异位点。其中变异频率较高的位点为rt64、rt178、rt154、rt160和rt126等。rt64位点变异虽然频率最高，但其单独变异并未引起NA耐药，且没有证据证明其与NA耐药相关。国外文献报道S53N、T54N、L82M、S85A、I91L、Y126C、T128I/N、N139D、W153O和F166L等可能为HBV潜在耐药变异位点，但这些位点尚未经体内外试验证实。某些位点如rt84、rt126、rt139、rt153、rt191和rt233等变异仅发生于C基因型患者[16]。但本实验在B基因型中也发现了rt84和rt126位点变异。

既往认为rtV84M和rtY126C可能与ADV耐药有关。本研究中rt84变异表现为rtV84C/T或T/C杂合，其与ADV耐药没有相关性。12例rt126变异表现为rtY126G/C（5/12）、rtY126C/G（5/12）和rtY126C/T (2/12)，但这12例患者均不对ADV耐药。

NA因其耐药发生率日益增高，且价格较为昂贵，故临床应用存在一定的局限性。目前，IFN-α联合NA抗病毒治疗方案已有初步研究报道。与IFN-α单一治疗相比，IFN-α联合ADV治疗能提高CHB抗病毒的疗效，尤其能提高HBV DNA阴转率和HBeAg清除率[17]，且不增加不良事件，甚至可以降低ADV耐药的发生。这无疑为早期部分单药治疗无效的患者带来了福音，我们需要更多的临床研究进一步探索联合治疗的疗效和安全性。

[1]Holomn J，Glasa J.EASL clinical practice guidelines.J Hepatol，2009，51（3）:821-822.

[2]Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et al.Antiviral drug-resistant HBV:standardization of nomenclature and assays and recommendations for management.Hepatology，2007，46（1）: 254-265.

[3]中华医学会传染病与寄生虫病学分会，肝病学分会.慢性乙型肝炎防治指南，实用肝脏病杂志，2006，9（1）：8-18.

[4]Shaw T，Bartholomeusz A，Locamini S.HBV drug resistance: mechanisms，detection and interpretation.J Hepatol，2006（2），44:593-606.

[5]Tan YW，Ge GH，Zhao W，et al.YMDD motif mutations in chronichepatitisBantiviraltreatmentnaivepatients:a multi-center study.Braz J Infect Dis，2012，16（3）:250-255.

[6]徐秋仙，张振纲，田德英，等.阿德福韦酯相关性HBV潜在耐药变异位点研究进展.传染病信息，2012，6（25）：186-189. [7]Bartholomeusz A，Locarnini S.Hepatitis B virus mutations associatedhepatitisB.KoreanJHepatol，2006，12（4）: 484-492.

[8]Zhong Y，Lv J，Li J，et al.Prevalence virology and antiviral drugssusceptibilityofhepatitisBvirusrtN238H polymerasemutationfrom1865Chinesepatientswith chronic hepatitis B.Antiviral Res，2012，93（1）:185-190.

[9]Gerolami R，Bourliere M，Colson P，et al.Unusual selection ofrtA181VHBVmutantscross-resistanttoadefovir following prolonged lamivudine monotherapy:report of two cases.Antivir Ther，2006，11:1103-1106.

[10]Villet S，Pichoud C，Billioud G，et al.Impact of hepatitis B virus rtA181V/T mutants on hepatitis B treatment failure.J Hepatol，2008，48（5）:747-755.

[11]Yokosuka O，Takaguchi K，Fujioka S，et al.Long-term use of entecavir in nucleoside-naive Japanese patients with chronic hepatitis B infection.J Hepatol，2010，52（6）:791-799.

[12]Gish RG，Lok AS，Chang TT，et al.Entecavir therapy for up to96weeksinpatientswithHBeAg-positivechronic hepatitis B.Gastroenterology，2007，133（5）:1437-1444.

[13]ShermanM，YurdaydinC，SollanoJ，etal.Entecavirfor treatment of lamivudine-refractory，HBeAg-positive chronic hepatitis B.Gastroenterology，2006，130（7）:2039-2049.

[14]薛瑞霞，张缭云，杨松，等.恩替卡韦治疗失败的慢性乙型肝炎患者耐药分析20例.世界华人消化杂志，2009，17（12）：1260-1263.

[15]杨方，张明香，魏倪，等.核苷（酸）类似物导致乙型肝炎病毒聚合酶区基因耐药变异的影响因素.中华肝脏病杂志，2010，18（10）：789-790.

[16]LiuBM，LiT，XuJ，etal.Characterizationofpotential antiviral resistance mutations in hepatitis B virus reverse transcriptase sequences in treatment-naive Chinese patients. Antiviral Res，2010，85:512-519.

[17]Wang YD，Zhao CY，Wang W，et al.Improved efficacy by individualized combination therapy with Peg IFN-α 2a and ADV in HBeAg positive chronic hepatitis B patients.Hepatogastroenterology，2012，59（115）:680-686.

（收稿：2013-09-22）

（校对：陈从新）

Mutation of hepatitis B virus DNA reverse transcriptase in 740 patients with hepatitis B and liver cirrhosis

Dai Mingjia，Fang Yuan，Wang Liping，et al.Department of Infectious Disease，Affiliated Hospital，Xuzhou Medical College，Xuzhou221002，Jiangsu Province，China

Objective Hepatitis B virus （HBV）genotypes and pre-core mutations were studied in patients with HBV infection. Methods Viral DNA was extracted from serum samples of 740 patients with hepatitis B and liver cirrhosis from August 2010 to October 2011，and HBV genotypes and pre-core mutations were detected by ABI sequencing instrument. Results Among 740 patients with HBV infection，40（5.41%）were with HBV genotype B，695 （93.92%）were with genotype C，and 5 （0.68%）were with genotype D infection；377 （50.95%）patients carried mutations related to lamivudine，adefovir dipivoxil and entecavir resistance，among whom 195 patients （51.72%）has a definite history of application of nucleos（t）ide analog （NA）. Out of the 195 patients，there were 12 patients with HBV genotype B and 183 with genotype C infection. Also among these patients with definite NA history，118 patients were with CHB，and 77 patients were with liver cirrhosis，and the major resistant mutations were M204V+L180M，M204，M204I+L180M and A181V；Serum HBV DNA load was related to NA resistance（x2=0.496，P＜0.001），but not age，gender，disease severity （CHB or cirrhosis）and ALT levels；Besides，a number of new mutations，e.g. rt64，rt126，rt178，rt129 and so on were found in this series. Conclusions The administration of NA might results in mutation of hepatitis B virus and drug resistance，and the mutations have certain characteristics. Dynamic monitoring of serum HBV DNA load will help early detection of gene mutation and drug resistance.

Hepatitis B；Mutation；Nucleos（t）ide analog；Drug-resistant目前，抗HBV治疗药物有干扰素（IFN-α）和核苷（酸）类似物（Nucleoside analogue，NA）[1，2]。我们采用对PCR产物直接测序法对740例HBV感染者血清进行了HBV P区测序分析，以期了解与耐药相关的基因变异特点及规律，从而指导患者的临床合理用药。

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.009

国家自然科学基金项目（编号：81371867）；2011年江苏省“科教兴卫”医学重点人才培养基金（编号：RC2011117）

221002 江苏省徐州市徐州医学院附属医院感染病科

戴明佳，女，27岁，硕士研究生。主要从事病毒性肝炎的临床研究。E-mail:daimingjia1009@126.com

颜学兵，E-mail:yxbxuzhou@126.com