精子表观遗传修饰及其在胚胎发育过程中的潜在作用

葛少钦, 赵峥辉, 张雪倩, 郝媛

1. 河北大学医学部, 保定 071000;

2. 河北大学生殖医学研究所, 保定 071000

精子表观遗传修饰及其在胚胎发育过程中的潜在作用

葛少钦1,2, 赵峥辉1, 张雪倩1, 郝媛1

1. 河北大学医学部, 保定 071000;

2. 河北大学生殖医学研究所, 保定 071000

精子发生(Spermatogenesis) 是一高度复杂的过程, 包括有丝分裂、减数分裂和精子形成。精母细胞经过独特而广泛的染色质与表观遗传修饰重塑之后, 最终分化产生了具有特定表观遗传修饰的精子。最近研究表明,成熟精子中的表观遗传修饰在发育的胚胎中发挥了重要作用, 其表观遗传模式的改变会导致某些疾病风险提高, 如受精失败、胚胎发生机能障碍、早产、出生体重低、先天畸形、新生儿死亡以及其他在辅助生殖技术后代中发现的发生频率较高的妊娠相关并发症。文章通过评价成熟精子中DNA甲基化、保留组蛋白修饰、RNAs和精蛋白等表观遗传修饰的重要意义及其在胚胎发育过程中的潜在作用, 阐述了成熟精子中改变的表观遗传修饰与相关疾病之间的关系, 为不育症的防治、精子表观遗传质量评价以及降低辅助生殖技术后代表观遗传疾病风险等提供基础资料。

表观遗传修饰; 精子; 胚胎发育; 疾病

表观遗传学(Epigenetics)是研究DNA序列不发生改变而生物表型和基因表达模式发生改变的一门学科。精子中的表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNAs和精蛋白等[1,2], 这些表观遗传修饰是精子的特征性标志物, 对保证精子的正常形态和机能至关重要。精子的表观遗传修饰在受精过程中会传递到卵母细胞, 对早期胚胎具有潜在的功能作用[3,4], DNA甲基化、组蛋白修饰、RNAs以及精蛋白等异常会导致精子机能降低和胚胎发育失败,甚至诱发后代表观遗传疾病的发生。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是一种有效促进基因沉默的表观遗传修饰。在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)催化下, S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团被共价结合到CpG二核苷酸胞嘧啶5’碳位上, 使DNA甲基化。CpG成簇富含于基因启动子附近, 称为“CpG岛”, 大多数甲基化的CpG岛位于基因内而非基因间区域[5], 通过与转录因子结合或改变染色质结构等有效抑制基因的表达[6]。

1.1 成熟精子中DNA甲基化

精子DNA甲基化的建立是一个独特的过程, 从原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)至成熟精子的复杂分化过程中, DNA甲基化呈动态变化。妊娠中期, 原始生殖细胞向生殖脊移行, 父系DNA的高甲基化修饰被擦除, 其甲基化失去大约 60%[7], 之后在精子发生的有丝分裂时期, 精子DNA在Dnmt3a及其辅助因子 Dnmt3L的作用下重新甲基化, 并在后来的减数分裂和精子形成时期维持高甲基化状态[8]。

然而, 通过基因本体分析发现, 成熟精子中调控发育转录和信号因子的启动子呈低甲基化状态,并且与人类胚胎干细胞自我更新网状转录因子绑定的发育启动子(如 OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和 FOXD3蛋白)相一致[9]。高度分化的精子细胞和具有高度分化潜能的胚胎细胞, 其启动子区相似的低甲基化状态是否意味着过程和结果的一致？是否还存在其他的可能机制？这些尚待进一步实验证明。

1.2 胚胎发育中DNA甲基化

受精后, 父系染色质普遍重塑, 伴随母源组蛋白替换了精子细胞核中的精蛋白, 父系基因组发生了主动去甲基化, 而母系基因组仍然保持高甲基化状态, 随着合子的分裂, 母系DNA甲基化水平逐步降低(图1)[10]。Ma等[11]通过总结胚胎发育早期DNA甲基化的变化规律, 发现种植前后, 在从头甲基化酶作用下, 父系基因组重新甲基化, 这种表观遗传重编程为早期胚胎发育成最初两种细胞系(内细胞团和滋养外胚层)做了准备[8]。然而父系基因组发生DNA甲基化的同时, CpG岛仍处于低甲基化状态,在胚胎发育早期, RNA聚合酶Ⅱ可以结合到多数CpG岛上, 募集组蛋白H3K4甲基转移酶, 使H3K4甲基化, 甲基化的H3K4可阻止Dnmt3L与CpG岛结合, 抑制DNA甲基化过程, 从而保持了CpG岛的低甲基化状态[12]。

1.3 精子中 DNA甲基化异常对受精后胚胎发育的影响

精子DNA甲基化主要由Dnmt催化, 胚胎发育过程中Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的失活可阻断胚胎早期重新甲基化的发生与维持, 进而造成胚胎发育异常。Kaneda等[13]通过小鼠基因敲除实验发现Dnmt1-/-小鼠发育迟缓, 在妊娠中期死亡; Lei等[14]通过突变实验发现 Dnmt3a-/-小鼠在出生 4周后死亡, Dnmt3b-/-小鼠在出生前死亡。此外, 利用药物也可以改变精子的甲基化状态。Kelly等[15]使用一种DNA甲基化抑制剂 5-脱氧氮-脱氧胞苷处理七周龄的雄性小鼠, 使精子DNA甲基化显著降低, 然后用这些小鼠和 8周龄未交配的雌性进行交配, 发现妊娠率明显下降, 并且胚胎着床前的损失率明显增加。Benchaib等[16]分析了63例精液样本中精子DNA甲基化状态, 也发现精子DNA低甲基化与妊娠结局密切相关。

图1 受精后至囊胚期甲基化水平及组蛋白变化情况[10]图上部所示为母源组蛋白替换精蛋白的过程; 图中部所示为受精后至囊胚期受精卵的分裂过程; 图下部所示为父源核 DNA主动去甲基化, 母源核DNA依赖父源核DNA被动去甲基化的过程。

Kobayashi等[17,18]研究显示, 不育男性精子中含有错误的印记基因, 并且存在甲基化状态的改变,甲基化的 DNA能够保持到受精后乃至整个早期胚胎中[8], 具有将此缺陷基因遗传给子代的更高风险。在射出的精子中, 错误印记发生在母本甲基化区域比发生在父本甲基化区域更常见, 在几个母本甲基化位置如PEG1、KCNQ1OT1、PLAGL1、PEG3和SNRPN的印记错误可能是印记擦除错误的结果。Prader-Willi综合征病人携带错误印记的染色体总是从祖母那遗传而来, 证明其发生了印记擦除错误[19]。这样, 患有精子减少症父亲的精子很可能会携带一个不正确的印记(在KCNQ1OT1和PEG1位置的超甲基化)传递给孩子。

2 组蛋白修饰

组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化等[20,21], 其修饰的最基本作用是调控基因表达。组蛋白甲基化多导致基因沉默,去甲基化则相反; 乙酰化一般使转录激活, 去乙酰化则相反[22]。

2.1 精子中组蛋白修饰

在精子发生有丝分裂、减数分裂和精子形成过程中, 组蛋白在一系列酶的催化下, 其尾部呈现出甲基化或乙酰化修饰, 这些组蛋白修饰单独或协同起作用, 促使基因活化或抑制[23]。有丝分裂时期, 在组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferase, HAT)催化下, 组蛋白H3、H4呈高度乙酰化状态[24], 乙酰基与组蛋白 H4上的赖氨酸残基结合, 中和赖氨酸所带正电荷, 使染色质结构松散, 易于与转录因子等转录相关蛋白结合[25]; 随后在组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferase, HMT)作用下, 组蛋白H3K4呈现甲基化状态, H3K4甲基化可以改变临近组蛋白甲基化修饰状态, 二者协同作用, 共同促进基因的转录。减数分裂时期, 在组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)作用下, 组蛋白H3、H4呈现低乙酰化状态, 在组蛋白去甲基化酶(Histone demethylase, HDM)作用下, H3K4呈现低甲基化状态,随后在HMT催化下, H3K9和H3K27甲基化, H3K9甲基化阻止RNA聚合酶Ⅱ与染色质结合, H3K27甲基化则阻止RNA聚合酶的前进, 二者同时出现, 抑制基因的转录[20,26,27]。精子形成时期, 组蛋白H4重新被乙酰化, 使核小体形成一个比较宽松的结构,易于精蛋白替代组蛋白[28,29]。成熟精子细胞核保留的组蛋白与核周相连结, 与端粒相结合[30], 与组蛋白结合的DNA序列包装不那样紧密, 认为该序列或基因参与了受精和早期胚胎发育[31]。

2.2 胚胎中组蛋白修饰

受精后, 精子细胞核在卵细胞胞质等因素的作用下去凝聚, 核组蛋白发生重组以解除染色质高度压缩和转录静止状态, 从而满足胚胎发育的需要。Biermann等[32]研究了受精卵中精子来源染色质重组的动力学机制, 发现组蛋白H4的8位和12位上乙酰化要早于精子核的去浓缩作用。Bui等[33]通过观察卵胞浆内精子注射(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)产生的胚胎发现, 在受精后的 1细胞期,父源核组蛋白H4K12迅速呈现出高乙酰化水平, 而组蛋白H3K9则呈现出低甲基化水平(图2)。随精卵染色质融合, 非对称性的组蛋白 H3K9甲基化被擦除, 至4细胞期时, 全基因组组蛋白H3K9又重新甲基化[34]。Bernstein等[35]通过检测小鼠 ES细胞中组蛋白甲基化修饰状态, 发现胚胎中保留有活化标记区域的组蛋白甲基化呈二价修饰状态, 因为某些区域的单价组蛋白修饰会抑制基因活化。这种组蛋白甲基化的二价修饰可以促进胚胎干细胞的全能性,是细胞全能性的标志。

图2 胚胎发育过程中组蛋白修饰及发展水平[33]A：绿色免疫荧光代表电镜观察胚胎 1细胞时期组蛋白 H4K12的乙酰化水平; B：绿色荧光代表胚胎4细胞时期父源与母源染色质组蛋白H3K9甲基化状态。

2.3 组蛋白修饰异常导致的疾病

组蛋白尾部甲基化和乙酰化修饰是精子发生及胚胎发育过程中基因转录表观遗传调节的主要形式。Fenic等[36]应用去乙酰化酶抑制剂处理小鼠, 使组蛋白乙酰化水平增高, 结果发现成熟精子的数量显著降低, 而且伴有生殖能力的丧失。Glaser等[37]认为不同程度生殖能力的降低都含有组蛋白甲基化和乙酰化修饰异常。精子中组蛋白甲基化修饰异常会造成精子发生过程中过渡性蛋白 1和精子中精蛋白1缺乏, 导致不同程度生育能力的丧失[38]。

3 RNA的作用

3.1 精子中的RNA

研究表明, 精子中含有许多特殊的RNAs, 如微小RNAs(miRNAs)和小干扰RNAs(Small interfering RNAs, siRNAs)等[39,40], 通过人类精子原位杂交实验发现这些 RNAs定位在整个精子的头部, 并且是核基质的组成成分。

miRNAs包含 18～23个核苷酸不等, 从发夹状双链RNA前体的特定区域产生, Marcon等[41]研究表明, miRNAs定位于精母细胞染色体的中心、终端以及XY染色体上, 也存在于支持细胞核中, 其在物种进化过程中具有高度的保守性[42], 有可能参与精子发生中有丝、减数及后减数分裂阶段的基因表达调节。miRNA-17-92群和miRNA-290-295群在培养3 d后的新生小鼠精原细胞中表达最丰富, 说明在精子发生过程中这两种 miRNA群在调节精原干细胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)增殖和早期分化过程中起重要作用[43]。siRNAs包含21～28个核苷酸不等, 源自双长链 RNA。Oatley等[44,45]研究发现, siRNA可抑制Bcl6b、Ets相关分子(Erm)及LIM同源框1的转录, 通过siRNA已经明确了这些转录因子都是体外实验中 SSCs自我更新所需的关键调节因子。在体内实验中, siRNA靶向阻断小鼠雄激素受体导致FGF2的表达下降, 表明睾丸酮对FGF2具有调节作用[46]。此外, 尽管已经从小鼠睾丸中分离得到另一种长度为 26～31个核苷酸的新型小分子piRNA(Piwi-interacting RNA), 但其并不存在于小鼠附睾精子中, 表明成熟精子中没有piRNA[47,48]。

3.2 胚胎中的RNA

在胚胎基因活化早期, 用于蛋白质合成的新生RNA对胚胎发育至关重要。Bui等[33]通过对比斯特兰小鼠孤雌生殖、孤雄生殖、ICSI、圆形精子注射(Round spermatid injection, ROSI) 4种胚胎中新生RNA的生成量, 阐明新生RNA对胚胎发育的影响。2细胞时期, 4种胚胎中新生RNA的含量虽然不同,但均达到了一个峰值; 2细胞末期, 孤雄生殖、ICSI、ROSI胚胎产生的新生RNA含量显著降低, 至4细胞期时达到最低点, 但孤雌生殖胚胎中新生RNA的含量则在4细胞期才开始显著降低; 4细胞末期, 各胚胎中的新生RNA开始积累, 新生RNA的含量在8细胞期以及囊胚期一直缓慢上升(图3)。在通过ICSI生成合子的 1细胞期, 新生 RNA的含量开始增多,同时H4K12也呈现出高乙酰化水平[33], 这表明新生RNA含量与组蛋白乙酰化水平呈正相关, 在其他生殖方式或同一生殖方式的不同细胞时期它们是否仍然呈正相关, 尚待进一步实验证明。

图3 胚胎发育早期新生RNA的相对强度[33]采用日本滨松市8～10周龄的B6D2F1 (C57BL/6J×DBA/2)斯特兰小鼠, 在孤雌生殖、ICSI、孤雄生殖、ROSI形成的胚胎中, 14(1细胞期)、24(2细胞期)、32(2细胞末期)、48(4细胞期)、54(4细胞末期)、62(8细胞期)、84(囊胚期) h检测新生RNA含量, 分析后制成新生RNA的相对强度图。

在ICSI产生的胚胎中, 2细胞期和4细胞期新生RNA的定位是不同的。通过激光共焦显微镜切片观察发现, 2细胞期的新生RNA存在于整个核仁内部,而4细胞期的新生RNA则在核仁周围。2细胞期, 臂间 DNA从核仁的外周解离与前染色质中心(Prochromocenters)结合, 而4细胞期, 臂间DNA则部分与前染色质中心结合, 因此认为这种 2细胞期到 4细胞期的改变抑制了新生RNA的生成[49]。

3.3 RNA异常所致疾病

孤雌生殖小鼠的出生表明, 在早期胚胎发育过程中, 可以没有父系RNA的参与。然而, 孤雌生殖小鼠的成功率很低(0.3%), 而且出生死亡率高(80%),这说明在雌核生殖胚球中存在一些基因补偿表达的缺失, 导致发育受阻。假设精子RNA在染色质重新包装以及维持父系印迹中起巨大作用, 那么孤雌生殖小鼠的低成活率, 可能是雌核生殖胚球中精子RNA的缺失引起的[50,51]。Dicer酶是miRNA成熟过程中的关键酶之一, 机体内编码 Dicer酶的基因缺失可以导致 miRNA合成障碍, 进而影响一系列miRNA参与调节的生物进程。Maatouk等[52]研究发现, Dicer酶缺陷的老鼠, 其生精小管内含有的圆形精子细胞数量较少, 甚至还有一些异常的延伸精子细胞, 这些精子细胞形态畸形且运动力低下, 因而增加了不育症的发生率。

4 精蛋白

4.1 精子中的精蛋白

精蛋白是精子的另一种表观遗传标志物[3], 精子中精蛋白的含量占核蛋白总量的85%～95%, 是精子中最丰富的核蛋白。精子染色质中精蛋白-组蛋白的替代, 致使精子染色质的结构重排, 染色质压缩 6～20倍, 这有利于成熟精子的运动和保护精子中的DNA免受损伤[53]。对受精后胚胎的正常发育至关重要。

4.2 胚胎中的精蛋白

受精后, 精子染色质中的精蛋白被来自卵细胞乙酰化的组蛋白替代, 完成由精子型向细胞型转变的过程。Rodman和Nonchev等[54,55]通过不同小鼠实验研究, 发现精蛋白去除时间不等, 最早在精子穿透卵子时立即发生, 最晚为受精后8 h。Shimada和Nakazawa等[56,57]通过猪体外受精实验, 确定组蛋白替换精蛋白发生在受精后2～4 h, 在3 h内约80%的精蛋白已经去除, 此时组蛋白开始与DNA结合, 约在4 h后完成。最近, Jones等[58]通过人类精子-仓鼠卵穿透实验, 发现不同受精卵精蛋白去除均在 1 h内完成。虽然不同物种受精后组蛋白替换精蛋白的时间不同, 但许多实验均表明这个过程必须在父系DNA的复制和转录前完成。

4.3 精蛋白异常所致疾病

精蛋白对于正常精子染色质凝聚, 保护其在运输过程中免受损伤是至关重要的[59]。人精蛋白 P1和P2的相对比严密调控在1:1左右, 生育力正常的男性很少发生改变, 而在不育男性中 P1/P2的改变则很普遍[60]。P1和 P2含量的改变及比值异常可导致精子DNA损伤。Aoki等[61]研究证实, Pl或P2含量降低或P1/P2比率降低患者的精子DNA损伤程度显著高于P1/P2值正常者或增高者, 因此, P1/P2比率的变化会导致胚胎质量下降。

5 问题与展望

精子表观遗传修饰, 如DNA甲基化、组蛋白修饰、RNAs和精蛋白等, 是保证精子细胞核正常并于卵胞浆内触发正常胚胎发育级联事件所必需的[62]。不完全的表观遗传修饰若出现在精子发生和胚胎植入前阶段, 会导致早期流产、胚胎发育和出生后遗传表型异常[63]。即使父方轻微或单一的表观遗传修饰异常都可能导致后代更为严重的表型缺陷和临床疾病[64]。DNA甲基化、组蛋白修饰、RNAs和精蛋白等表观遗传修饰共同发挥作用, 确保精子发生和胚胎发育正常。共同或任一修饰异常都会导致受精减少、胚胎发生障碍以及胚胎植入和妊娠率降低[20,65]。

精子表观遗传学研究有助于理解当前男性生育力降低这一复杂多因素疾病产生的分子机制和评价男性不育疾病的传代风险, 有助于通过控制精子表观遗传质量来降低ICSI后代表观遗传疾病的发病风险。但值得注意的是, 当前大多数有关表观遗传缺陷的研究是在评价一份射出精液的平均水平[2], 而一份正常精液样本会包含相当数量形态异常的精子细胞、少量不成熟的精子细胞和不定量的体细胞,只是在不育患者精液中异常精子细胞和非精子细胞的比例会大幅度增加[53]。对于同一精液样本中的不同精子, 一些表观遗传修饰因子区别明显[66]。这样,对一份精液样本进行平均水平的评价, 精液中相对正常的精子会受到影响, 缺陷精子遗传与表观遗传特征则被掩盖, 如何评价用于IVF或ICSI的单个精子的特异信息是始终困扰基础和临床生殖研究专家的难题[67]。

研究评价表观遗传因子与男性不育或胚胎发生之间的关系还处于起步阶段, 表观遗传修饰异常的临床影响还有待于更进一步研究, 非常有必要用更多的手段来评价遗传和表观遗传缺陷的遗传风险,以提供比较安全的不育治疗方案。为加强精子表观遗传研究的系统性、特异性和临床应用性, 本实验室与美国犹他大学Andrology and IVF实验室联合开展了精子形态分类(WHO标准)基础上的表观遗传因子定位定量分布研究, 试图建立精子表观遗传质量评价标准, 确定不同形态精子表观遗传缺陷, 指导ICSI临床选用高表观遗传质量的精子, 为不育患者提供辅助生殖技术治疗的合理化建议, 以降低 ICSI后代表观遗传疾病风险。

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(责任编委: 苗龙)

Epigenetic modifications in human spermatozoon and its potential role in embryonic development

Shaoqin Ge1,2, Zhenghui Zhao1, Xueqian Zhang1, Yuan Hao1

1. Hebei University Health Science Center, Baoding 071000, China;
2. The Institute for Reproductive Medicine of Hebei University, Baoding 071000, China

Spermatogenesis is a highly complex process involving mitotic cell division, meiosis and the process of spermiogenesis, during which unique and extensive chromatin and epigenetic modifications are remodeled to bring about specific epigenetic profiles for spermatozoa. Recent studies have shown that epigenetic modifications in mature spermatozoon play an important role in the developing embryo and its alterations in epigenetic patterns may increase the risk for fertilization failure, dysfunction of embryogenesis, preterm birth, low birthweight, congenital anomalies, perinatal mortality, and several other pregnancy-related complications seen at a higher frequency in babies conceived by in vitro fertilization (IVF). In this review, we assess the significance of epigenetic modifications (DNA methylation, histone retention and modification, RNAs and protamine) in mature spermatozoon and its potential role in embryonic development, and elucidate the relationship between altered epigenetic profile and associated diseases, providing basic information for preventing andtreating male infertility, evaluating the epigenetic quality of sperm and reducing the risk of epigenetic diseases with babies conceived by assisted reproductive technology (ART).

epigenetic modifications; sperm; embryonic development; diseases

2014-02-09;

2014-03-27

河北省自然科学基金项目(编号：H2013201259)和河北省2013留学回国人员科研活动项目(编号：C2013005002)资助

葛少钦, 博士后, 教授, 研究方向：生殖医学, 动物分子与生化。E-mail: gesq67@sina.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0439

时间: 2014-4-24 9:00:10

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140424.0900.004.html