黑龙江省烟草角斑病菌菌系分化研究

孙剑萍，文景芝，孙宏伟，王春军，张 萌，郭兆奎

（1.牡丹江烟草科学研究所，黑龙江 牡丹江 157011；2.东北农业大学，哈尔滨 150030；3.牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157011）

烟草角斑病在世界各地均有发生，是烟草产区普遍发生的病害之一，由丁香假单胞杆菌角斑专化型 Pseudomonas syringae pv.Angulata（Fromeetal）Holland侵染引起。近些年来，由于生产上单一感病品种的连片种植，给烟草角斑病的流行创造了良好的条件，使该病害逐年加重，特别是黑龙江、辽宁等省发病最为严重，个别烟区发病率高达100%，已严重威胁部分烟区烟叶生产的发展[1-2]。利用抗病品种是最经济、安全、有效的方法。而目前生产上的植烟品种对该病害的抗性都较差，甚至是严重感病[3]，又没有安全有效的化学手段防治该病害，一旦发病，便束手无策。因此选育适合的抗病品种尤为重要，为育出具有针对性的、抗性强的广谱抗病品种，就必须掌握当地病原菌株的种群分布及遗传分化情况[1,4]。笔者对黑龙江省烟草角斑病菌菌系分化现象进行了深入研究，以期为监测黑龙江省角斑病菌种群动态，合理优化品种布局、选育广谱抗病品种及烟草角斑病的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种

供试烟草品种包括国外引进品种，国内外种植的品种，目前黑龙江省烟区主栽品种，以及野生鉴别寄主黄花烟（Nicotiana rustica）和长花烟（N.longiflora Cav.）共36个，见表1。

表1 供试烟草品种Table1 Tobacco cultivars used for the test

1.2 供试菌株

供试菌株于2012年采自黑龙江省15个主产烟区的烟草角斑病病叶，经平板划线法分离、多次单菌落纯化并鉴定后得到 19个菌株，菌株保存在KBA斜面备用，并置于75%甘油溶液中，-70 ℃长期保存[5]。2013年试验前在超净工作台无菌操作环境下将各菌株分别接到LB液体培养基中置于26 ℃摇床中振荡培养24 h，转速200 r/min。再将活化后的菌株重新进行平板划线分离和单菌落纯化，作为供试菌株待接种用，各菌株见表2。

1.3 人工接种

试验于 2013年在牡丹江烟草科学研究所试验基地（宁安市范家乡）进行。

1.3.1 田间试验设计 将 19个供试菌株分别接种到36个供试烟草品种上。每个品种接种3株烟，每株烟接种在第8～12片叶上，并设1个对照（不接种病原菌）。重重4次，随机区组试验设计。

1.3.2 菌悬液的配制 将上述供试菌株转至LB液体培养基中，28 ℃培养18～24 h，经灭菌水稀释后，配制成3×108～5×108cfu/mL菌悬液，以供接种。

1.3.3 接种方法 在烟株团棵期的第8～12片叶上，各针刺接种10个接种点，接种前2 h将试验田全部灌水至土壤饱和状态，增加试验田湿度，接种后每隔2 h清水喷雾，保持试验田湿度。

表2 供试烟草角斑病菌株来源Table2 Sources of Pseudomonas syringae pv.tabaci for test

1.4 调查、统计及分析方法

1.4.1 病情的调查、统计及分析 接种10 d后，调查发病程度，计算病情指数。采用 Statistics软件v19.0.0版对病情指数进行方差分析，并用系统聚类法对36个烟草品种进行聚类分析。

1.4.2 角斑病的分级 根据黑龙江省烟草角斑病发生规律、发生程度及叶部病害的发病特点，并参考中华人民共和国烟草行业标准 YC/T341.6—2010中对烟草野火病、角斑病发生程度的分级指标，将本试验中各烟草品种的抗感划分标准如下，见表3。

表3 烟草角斑病的分级标准Table3 The scale of disease severity

2 结 果

2.1 烟草品种抗病性及菌种致病性差异比较

对接种后的试验结果进行方差分析（表 4）表明，供试烟草品种间、菌株间的差异极显著，说明供试烟草品种对烟草角斑病的抗病性表现以及菌株间的致病力表现存在显著差异。同一烟草品种对不同菌株的抗病力不同，同一菌株对不同烟草品种的致病力也不同，证明烟草角斑病病菌存在遗传分化现象。

表4 烟草角斑病病情指数方差分析Table4 Analysis of variation on disease index

2.2 烟草品种抗性的聚类分析

通过供试品种对 19个菌株病情指数的不同表现，将36个烟草品种分为6个类群（图1），其中长花烟为一群（1号群）；黄花烟为一群（2号群）；Cui-1为一群（3号群）；NC89、G80、LJ935和LJ237为一群（4号群）；Coker411和B-21为一群（5号群）；Yunyan87、Coker176、LJ911、K346、K326、小花青、G28、9833-514、NC82、YH-02、Yunyan97、中烟 100、LJ925、JY-02、LJ912、Nanka58、8304-1、长脖黄、大青筋、Hongda、CF80、TL106、9861-81、KY14、LJ851、Yunyan85和NC95为一群（6号群）。

2.3 烟草角斑病菌鉴别寄主的选择

图1 36个烟草品种的聚类图Fig.1 Clustering of 36 tobacco cultivars

建立一套合理的鉴别寄主体系需要有抗感表现稳定、抗感类型丰富、来自主产烟区的代表品种。根据这一原则及上述差异性分析及聚类分析结果，从 36个供试烟草品种中筛选出具有较好鉴别能力的 5个品种作为黑龙江省烟草角斑病菌的鉴别寄主。1号群中的长花烟作为高抗品种；在4号群中选出的G80作为中抗代表品种；在5号群中选出的Coker411作为抗病代表品种；3号群中的Cui-1作为中感品种；在6号群中选出的Yunyan 97作为高感代表品种。

2.4 烟草角斑病菌生理小种的划分

用长花烟（A）、G80（B）、Coker411（C）、Cui-1（D）、Yunyan 97（E）作为烟草角斑病的鉴别寄主，根据角斑病等级划分标准（表3），将所有供试菌株划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等5个生理小种（表5）。

表5 供试菌株的生理小种组成Table5 The identification of physiological race of Pseudomonas syringae pv.Tabaci

3 讨 论

目前国内外对烟草角斑病菌生理小种遗传分化现象的研究还未见报道，烟草角斑病菌生理小种的划分在国际上还是空白[6]。本研究是采集19个烟草角斑病菌菌株，通过其对 36个供试烟草品种致病力重复表现差异进行聚类分析所得出的结论，能较为真实的反映黑龙江省烟草角斑病菌的致病力分化。但对病害生理小种的划分需要大量的病原菌进行多次重复试验，因此还需继续扩大菌株数量进行多次重复验证。

本试验采集的 19个烟草角斑病菌菌株来自黑龙江省 15个烤烟产区，其中有同一个产区的角斑病菌菌株被划分为同一个生理小种，也有同一个产区的角斑病菌菌株被划分为不同的生理小种，这种现象在自然界植物与病原菌的互作中普遍存在，病原菌的繁殖速度快，个体微小，与外界环境的接触面积大，可在短时间内产生大量的变异后代，并且容易受到环境条件的影响而发生变异。寄主植物和病原物在自然界中能够长期共存，得益于两者之间不断的相互选择和相互适应而协同进化，正是这种协同进化产生了寄主植物的抗病性不同和病原物的致病力不同，进而产生了病原物株系的分化，同一烟区的烤烟和角斑病菌之间的协同进化速率不同，而产生了不同致病力的角斑病菌，因此同一烟区采集来的角斑病菌被划分为不同的生理小种是有可能存在的。近几年，黑龙江省正逐步更换烤烟品种，再加上面积较大的烟区有着不同的气候条件和土壤条件，也进一步导致了角斑病菌的生理小种在同一烟区出现了分化。本试验旨在明确黑龙江省烟草角斑病菌的生理小种分化，因此在省内的同一烟区采集的角斑病菌较少，要想明确一个烟区的病原菌的生理小种组成，还需在这个烟区大量采集病原菌，选择合适的鉴别寄主，进行详细的生理小种鉴定试验，这是笔者下一步的工作。

当前，在多种作物的病原菌生理小种鉴定上，已使用单基因抗病品种（系）作为鉴别寄主[7]，而在烟草上采用这样的鉴别寄主鉴定烟草角斑病生理小种，尚需明确鉴别寄主中的角斑病抗性基因。目前全球第一套烟草全基因组序列图谱——绒毛状烟草和林烟草全基因组序列图谱已完成，将为烟草抗病基因的定位﹑克隆创造条件，为进一步采用分子生物学技术对烟草角斑病菌生理小种的遗传多样性分析创造条件。

4 结 论

试验分析结果显示，黑龙江省烟草角斑病菌与烤烟品种的致病力和抗病力间存在显著差异，说明烟草角斑病菌存在遗传分化现象。

通过对来自不同产区采集的 19个烟草角斑病菌菌株与 36个供试烟草品种致病力的差异性分析和聚类分析，按照鉴别寄主体系的建立标准选出长花烟作为鉴别寄主体系中的高抗品种、G80作为中抗代表品种、Coker411作为抗病代表品种、Cui-1作为中感品种、Yunyan 97作为高感代表品种组成的鉴别寄主体系，将供试的 19个烟草角斑病菌菌株划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等5个生理小种。

[1]孙剑萍，孙宏伟.黑龙江省烟草野火病菌生理小种鉴别寄主的筛选[J].烟草科技，2011（10）：75-77.

[2]河南农业大学，云南农业大学.烟草病理学教程[M].北京：中国科学技术出版社，1995.

[3]张世珖，陈惠明.11个烟草品种对烟草病菌的抗性鉴定[J].烟草科技，1989（1）：29-31.

[4]彭润，张世珖.云南烟草野火病生理小种分化的研究[J].植物病理学报，2005，35（1）：1-5.

[5]刘雅婷.云南烟草野火病的发生规律研究(I)[D].昆明：云南农业大学，2001.

[6]Woodend J J, Mudzengerere E.Inheritance of resistance to wildfire and angular leaf spot derived from Nicotiana rustica Var[J].brasilea Euphytica, 1992, 64(1-2)∶149-156.

[7]佟道儒.烟草育种学[M].北京：中国农业出版社，1997：453-457.