RP-HPLC法同时测定人血浆中马钱子4种生物碱的含量

翁德新，戴其昌（1.德清县第三人民医院药剂科，浙江 德清 31300；.湖州市食品药品检验所，浙江 湖州 313000）

马钱子，也称番木鳖，为马钱科植物马钱Strychnos nuxvomica L.或云南马钱S.pierriana A.W.Hill的干燥成熟种子，其味苦、性寒、有大毒，在中医药临床上用于通络止痛、散结消肿。现代医学理论证明，马钱子具有抗肿瘤作用[1]。马钱子中的各种生物碱是马钱子的主要有效部位，其中番木鳖碱（Strychnine）、马钱子碱（Brucine）、番木鳖碱氮氧化物（Strychnine N-oxide）和马钱子碱氮氧化物（Brucine N-oxide）是较为重要的生物碱[2-4]。马钱子的体内分析研究较少，通常是单一成分检测或两种成分一起检测[5]，目前未见4种成分一起检测的方法。本研究建立了同时检测人血浆中马钱子4种生物碱类成分含量的方法，以为马钱子的体内药动学分析提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱（HPLC）仪（日本岛津公司）；AE-240S型十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-100型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（上海沪西分析仪器厂）；3K15型离心机（德国Sigma公司）。

1.2 药品与试剂

番木鳖碱（批号:110705-200306）、马钱子碱（批号:110706-200505）、石杉碱甲（批号:100243-200601）对照品均购自中国食品药品检定研究院；番木鳖碱氮氧化物、马钱子碱氮氧化物对照品（德国Carl GmBH公司，纯度均＞98%）；十二烷基硫酸钠为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:HYP-ODS C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-0.2%十二烷基硫酸钠溶液（40∶60，V/V，pH2.8）；流速:1.0ml/min；柱温:30 ℃；检测波长:254nm；进样量:20μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒质量的番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物对照品适量，用流动相溶解并定容至同一25ml量瓶中，制备成质量浓度分别为0.356mg/ml（番木鳖碱）、0.357mg/ml（马钱子碱）、0.356mg/ml（番木鳖碱氮氧化物）、0.355mg/ml（马钱子碱氮氧化物）的混合对照品溶液，即为混合对照品母液，4℃贮藏，备用。精密移取混合对照品母液0.5ml，置1ml量瓶中，用甲醇定容，混匀，即为混合对照品系列溶液①。再分别精密移取混合对照品系列溶液①3ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容，混匀，为混合对照品系列溶液②。然后分别精密移取混合对照品系列溶液②0.5、1、5、10、20、50ml，置50ml量瓶中，用甲醇定容，混匀，得混合对照品系列溶液③～⑧，其中番木鳖碱的质量浓度分别为0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml，马钱子碱的质量浓度分别为0.54、1.07、5.36、10.71、21.42、53.55μg/ml，番木鳖碱氮氧化物的质量浓度分别为0.53、1.07、5.34、10.68、21.36、53.40μg/ml，马钱子碱氮氧化物的质量浓度分别为0.53、1.06、5.33、10.65、21.30、53.25μg/ml。4 ℃贮藏，备用。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒质量的石杉碱甲对照品适量，以甲醇溶解制得质量浓度为40.02μg/ml的内标溶液。4℃贮藏，备用。

2.2.3 质控样品的制备 分别取“2.2.1”项下混合对照品系列溶液10μl与内标液10μl，置50μl空白血浆中，得高、中、低质量浓度的质控样品，即番木鳖碱血浆浓度分别为53.40、10.68、0.50μg/ml、马钱子碱血浆浓度分别为53.55、10.71、0.54μg/ml、番木鳖碱氮氧化物血浆浓度分别为53.40、10.68、0.50μg/ml，马钱子碱氮氧化物血浆浓度分别为53.25、10.65、0.53μg/ml。－20℃贮藏，备用。

2.3 血浆样品的处理

精密吸取人血浆样品50μl，加入“2.2.1”项下混合对照品系列溶液50μl、石杉碱甲20μl、氨水20μl，涡旋2min，再加入乙腈600μl沉淀蛋白，涡旋3min，以离心半径为13.5 cm、15000 r/min离心 5min，取上清液20μl进样。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 取“2.2.3”项下中质量浓度的质控样品溶液适量，按“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，马钱子碱氮氧化物、石杉碱甲、番木鳖碱氮氧化物、番木鳖碱和马钱子碱的保留时间分别为3.5、5.2、7.3、24.7、30.8min，血浆中所含的内源性物质不干扰被测物和内标的测定，且峰形良好。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图1.马钱子碱氮氧化物；2.石杉碱甲；3.番木鳖碱氮氧化物；4.番木鳖碱；5.马钱子碱Fig 1 HPLC chromatograms1.brucine N-oxide；2.huperzine A；3.strychnine N-oxide；4.strychnine；5.brucine

2.4.2 标准曲线的制备 取“2.2.1”项下混合对照品系列溶液③～⑧，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以待测物质量浓度（x）为横坐标，待测物的峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归。回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围（n＝6）Tab 1 Regression equation and linear range（n＝6）

2.4.3 精密度试验 按“2.2.3”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定日内精密度（6次）、日间精密度（6 d）。结果，番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物、马钱子碱氮氧化物日内、日间精密度的RSD均小于9.0%，表明本方法精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取“2.2.3”项下中质量浓度的质控样品溶液5份，置4℃下24h后测定，考察血浆样品的短期稳定性；另取该溶液5份，贮藏于－70℃，30d后测定，考察血浆样品的长期稳定性；再取该溶液5份，在室温中充分解冻，然后再次冷冻，每次间隔24h，重复3个冻融周期后测定，考察血浆样品的3周期冻融稳定性。稳定性试验结果见表2。

表2 稳定性试验结果（n＝5）Tab 2 Results of stability tests（n＝5）

2.4.5 提取回收率试验 取“2.2.3”项下高、中、低质量浓度的质控样品适量，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。与未经处理的相应质量浓度的对照品溶液峰面积比较，计算番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物的回收率，结果见表3。

表3 提取回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results of extraction recovery tests（n＝6）

3 讨论

马钱子在炮制为制马钱子过程中，番土鳖碱和马钱子碱可转化成相应的氮氧化合物[6]，可能在体内会转化为极性更高的氮氧化合物，而且其氮氧化合物与原生物碱的药理药效相当[7]，因此研究番土鳖碱、马钱子碱、番土鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物具有参考价值。

2010年版《中国药典》对番木鳖碱和马钱子碱进行HPLC测定，流动相为庚烷磺酸钠[8]，本课题组参考文献[9]的流动相用十二烷基硫酸钠替代庚烷磺酸钠，调pH为2.8，未加磷酸二氢钠，流动相的制备更方便简单，也获得了较好的分离效果。

番木鳖碱、马钱子碱、番木鳖碱氮氧化物和马钱子碱氮氧化物均为碱性物质[10]，本研究采用氨水碱化血样，使得各生物碱以游离分子形式存在，从而提高了生物碱从血浆提取的效率，与王丹丹等[11-12]采用三乙胺作为流动相有相似的原理。有研究采用氯仿提取并溶解番木鳖碱，但笔者筛选了几种有机溶液，发现乙腈的提取率最高，而采用氯仿提取时处理有难度，且番木鳖碱在放置过程中有降解，与文献结果相似[13]。

综上所述，本研究采用RP-HPLC法同时测定人血浆中马钱子4种生物碱的含量，本方法简单、快速、灵敏和准确，可以作为马钱子4种生物碱的药动学研究方法。

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