红芪水提物对急性肺损伤模型大鼠的保护作用Δ

向红，王雅莉，邱桐，金尧，杨雪芳（.甘肃中医学院病理学教研室/甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州 730000；.甘肃中医学院中药资源教研室，兰州 730000）

急性肺损伤发病机制错综复杂、致病环节多、病死率高，已成为临床危重病学研究的难点和热点。但是，目前中医、西医都没有确切的方法和药物阻止其疾病发展[1-2]。红芪为豆科植物多序岩黄芪（Hedysaryum Polybotrys）的干燥根[3]，红芪水提物是从红芪中提取的一种复合生物碱，研究已证实其可提高肺表面活性物质含量、清除自由基、减少过氧化物酶和丙二醛生成、增强免疫力、抗衰老[4-7]。已有研究证明，红芪水提物能减轻新生儿呼吸窘迫综合征时肺脏的出血、充血、水肿及炎细胞浸润，使肺表面活性物质的分泌增加[8]。肿瘤坏死因子（TNF）-α是炎症因子网络的启动因子，白细胞介素（IL）-10与核因子（NF）-κB活化有关，二者在急性肺损伤的发生发展中起关键作用[9-10]。本研究拟通过观察红芪水提物对急性肺损伤模型大鼠各病理指标的影响，探讨其对急性肺损伤模型大鼠的保护作用及可能的机制。

1 材料

1.1 仪器

洁净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）；KX31型光学显微镜（日本Olympus公司）；Microm HM315型切片机（美国Thermo公司）；YB-6LF型生物组织包埋机（湖北亚光医用电子技术有限公司）；FA1204B型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 药材

红芪生药材由甘肃中医学院中药药剂教研室提供，经笔者鉴定为真品。

1.3 试剂

内毒素（LPS，美国Sigma公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；TNF-α、IL-10免疫组化试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。

1.4 动物

SPF级Wistar成年大鼠60只，♀♂兼用，体质量（200±20）g，购自甘肃中医学院实验动物中心[实验动物使用合格证号:SCXK（甘）2011-0001-0000372]。

2 方法

2.1 复制模型与分组、给药[11-14]

ip LPS（5mg/kg）以复制大鼠急性肺损伤模型。60只Wistar大鼠随机均分为6组，即正常对照组（等容生理盐水）组、模型（等容生理盐水）组、地塞米松（10mg/kg）组与红芪水提物高、中、低剂量（5.2、2.6、1.3 g/kg）组，复制模型4 h后ig给药，每天1次，连续3 d。

2.2 指标的检测

2.2.1 肺系数（LI）、肺湿/干质量比（W/D）与肺含水率的测定

末次给药后，脱颈处死大鼠，取大鼠全肺，用滤纸吸取浮在脏器表面的血液或体液，用电子天平称定质量，按如下公式计算LI:LI＝肺质量（mg）/体质量（g）×10。取大鼠左肺，称湿质量后，置烤箱中（60℃，48 h），取出，称干质量，然后计算W/D与肺含水率:W/D＝肺湿质量（mg）/肺干质量（mg）×100%；肺含水率＝（肺湿质量－肺干质量）/肺湿质量×100%。

2.2.2 肺组织病理学检测 取大鼠右肺中叶用4%甲醛固定48 h，切取肺组织块2～4mm3常规脱水、石蜡包埋、切片，用苏木紫-伊红染色。在光学显微镜下观察大鼠肺泡间隔病变、炎症细胞浸润、血管瘀血状况等组织形态学变化。

2.2.3 免疫组化法检测TNF-α、IL-10蛋白的表达 取大鼠右肺中叶组织，常规脱蜡、水化后，柠檬酸浸泡，高压锅加热进行抗原修复，滴加3%H2O2消除内源性过氧化物酶和生物素，再按以下步骤进行操作:①滴加正常山羊血清封闭，温箱育10min，倾去，勿洗；②滴加一抗工作液（TNF-α、IL-10均稀释150倍），37℃3 h，PBS冲洗3次，每次3min；③滴加二抗，37℃15min，PBS冲洗3次，每次3min；④滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液，37℃15min，PBS冲洗3次，每次3min；⑤滴加DAB显色剂，3min后放入自来水中浸泡10min；⑥苏木素复染2min，盐酸酒精分化，再放入氨水中浸泡；⑦脱水、透明、封片，镜下观察。所有切片放大倍数为40倍，每张切片观察随机选取10个视野（直径为1mm），利用LEICAQwin图像分析软件测定阳性反应物相对含量的平均灰度值，以其单位面积平均灰度作为表达量的参数。

2.3 统计学方法

3 结果

3.1 红芪水提物对模型大鼠LI、W/D与肺含水率的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠LI、W/D、肺含水率增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，红芪水提物高、中、低剂量组大鼠LI、W/D、肺含水率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。红芪水提物对模型大鼠LI、W/D与肺含水率的影响见表1。

表1 红芪水提物对模型大鼠LI、W/D与肺含水率的影响（）Tab 1 Effects of water extract of H.polybotrys on LI，W/D and moisture content of lung in model rats（）

表1 红芪水提物对模型大鼠LI、W/D与肺含水率的影响（）Tab 1 Effects of water extract of H.polybotrys on LI，W/D and moisture content of lung in model rats（）

与正常对照组比较:＊P＜0.01；与模型组比较:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05

组别正常对照组模型组地塞米松组红芪水提物高剂量组红芪水提物中剂量组红芪水提物低剂量组肺含水率，%80.24±1.9089.58±0.89＊83.61±1.10#83.33±1.46#86.69±1.17#86.92±0.75#n 101010101010 LI 0.55±0.0361.16±0.14＊0.65±0.069#0.60±0.068#0.78±0.090#0.84±0.070#W/D 5.10±0.469.66±0.82＊6.12±0.40#6.04±0.56#7.56±0.64#7.67±0.44#

3.2 红芪水提物对模型大鼠肺组织病理形态学的影响

正常对照组大鼠肺组织未见明显异常，肺泡结构清晰，大小均匀，肺泡壁薄，肺泡隔微血管无充血、瘀血；模型组大鼠肺泡和肺间质水肿，肺间隔明显增宽，肺泡腔变窄，肺泡内渗出物较多，炎性细胞浸润，可见较多的中性粒细胞、红细胞；地塞米松组大鼠肺组织结构尚清晰，破坏较轻，肺充血水肿减轻，炎性细胞浸润现象明显减轻或者消失；红芪水提物高剂量组大鼠肺组织结构清晰，肺泡间隔变窄，红细胞及中性粒细胞渗出减轻，肺组织病理损伤明显改善；红芪水提物中、低剂量组大鼠肺泡腔内出血程度、水肿及肺泡腔内炎症细胞数量低于模型组。红芪水提物对模型大鼠肺组织病理学的影响见表2。

表2 红芪水提物对模型大鼠肺组织病理学的影响Tab 2 Effects of water extract of H.polybotrys on histological changes of lung tissue in model rats

3.3 红芪水提物对模型大鼠TNF-α、IL-10蛋白表达的影响

3.3.1 红芪水提物对模型大鼠TNF-α蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠肺组织TNF-α蛋白表达增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，红芪水提物高、中剂量组大鼠肺组织TNF-α蛋白表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.01）。红芪水提物对模型大鼠TNF-α蛋白表达的影响见表3。

表3 红芪水提物对模型大鼠TNF-α蛋白表达的影响（）Tab 3 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of TNF-α protein in model rats（）

表3 红芪水提物对模型大鼠TNF-α蛋白表达的影响（）Tab 3 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of TNF-α protein in model rats（）

与正常对照组比较:＊P＜0.01；与模型组比较:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

组别正常对照组模型组地塞米松组红芪水提物高剂量组红芪水提物中剂量组红芪水提物低剂量组平均灰度值66.45±9.56128.06±10.13＊95.56±6.65#75.06±4.65#79.67±7.17#98.83±10.70 n 101010101010

3.3.2 红芪水提物对模型大鼠IL-10蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠IL-10蛋白表达减弱，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，红芪水提物高、中、低剂量组大鼠IL-10蛋白表达增强，差异有统计学意义（P＜0.01）。红芪水提物对模型大鼠IL-10蛋白表达的影响见表4。

表4 红芪水提物对模型大鼠IL-10蛋白表达的影响（）Tab 4 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of IL-10 protein in model rats（）

表4 红芪水提物对模型大鼠IL-10蛋白表达的影响（）Tab 4 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of IL-10 protein in model rats（）

与正常对照组比较:＊P＜0.01；与模型组比较:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

组别正常对照组模型组地塞米松组红芪水提物高剂量组红芪水提物中剂量组红芪水提物低剂量组平均灰度值112.06±10.1366.45±9.56＊106.07±7.17#98.56±6.65#94.83±10.70#82.52±10.13#n 101010101010

4 讨论

本研究中，ip LPS以后，大鼠肺组织出现明显肿胀、全肺充血，LI、W/D及肺含水率明显升高，光镜下大鼠肺组织呈现明显的急性肺损伤病理变化，说明急性肺损伤模型复制成功。ig红芪水提物后各组大鼠肺损伤程度明显改善，提示红芪水提物可以有效地改善急性肺损伤状况，使大鼠肺组织肿胀减轻，LI、W/D及肺含水率下降，肺组织病理损伤指标明显改善。同时，与模型组比较，红芪水提物高、中、低剂量组大鼠TNF-α蛋白表达水平明显减弱，红芪水提物高、中剂量组大鼠IL-10表达明显增强，证实了红芪对炎性因子的调节作用，说明红芪可以通过降低TNF-α等前炎性反应因子、增强抗炎因子IL-10的表达，重建体内炎症介质/抗炎介质的平衡，从而抑制急性肺损伤的发展，对急性肺损伤模型大鼠具有保护作用。其中，红芪水提物高剂量组效果明显，其对TNF-α和IL-10蛋白表达的调节作用均优于中、低剂量组。红芪水提物对TNF-α与IL-10调节的作用机制可能是[15-16]:（1）红芪水提物通过降低细胞前炎症因子，从而抑制中性粒细胞和单核细胞炎症介质的释放；（2）红芪水提物可以改善肺泡细胞的缺氧和营养缺乏，增强抗炎因子的表达；（3）红芪水提物能够修复受损的内皮细胞，阻断其与中性粒细胞的黏附，从而抑制其他炎症介质，如前列腺素、IL-6和IL-8等的释放。

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