银杏内酯B对内皮细胞连接蛋白的影响及其分子机制研究

刘雪青，陈北冬，鲍 利，吴 伟，孙文佳，齐若梅

（卫生部北京医院／老年医学研究所，卫生部老年医学重点实验室，北京 100730）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性血管炎症性疾病［1］，其病理过程涉及血管内皮细胞损伤、血小板活化、白细胞浸润等。内皮细胞受损在动脉粥样硬化过程中是一个主要的病理特征。生理状态下，内皮细胞通过细胞之间的紧密连接蛋白阻止循环中的有害成分向血管内膜下渗透。在动脉粥样硬化血管炎症的病理状态下，循环中的细胞因子和趋化因子增多，损伤内皮细胞连接蛋白功能，导致血管渗透性增高，炎症细胞向血管内膜下浸润，促进动脉粥样硬化的血管炎症反应。

内皮细胞连接蛋白功能主要包括紧密连接（tight junction，TJ）、缝隙连接（gap junction，GAP）和黏着连接（adherens junction，AJ）。JAM-A（junctional adhesion molecule A）是参与构成紧密连接复合体的重要蛋白，可通过密闭小带ZO（zonula occuden）与细胞骨架相连，具有调节血管渗透性、参与白细胞迁移等功能。临床研究［2］表明动脉粥样硬化患者血浆中JAM-A的水平明显增高，TNFα促进内皮细胞JAM-A的表达，从而增强血小板与内皮细胞黏附。Cx43（connexin 43）是组成缝隙连接的基本单位，在相邻细胞之间形成通道结构，允许可溶性小分子在相邻细胞间通过，维持血管内皮的稳态。研究发现［3］，早期动脉粥样硬化内膜增厚区Cx43明显增多。本研究重点探讨ox-LDL损伤内皮细胞JAM-A和Cx43的变化以及药物干预的影响。

银杏内酯B（ginkgolide B，GB）是血小板活化因子受体拮抗剂，我们先前的研究表明［4］，银杏内酯B对ox-LDL刺激的内皮细胞损伤具有保护作用。然而，银杏内酯B是否能够改善内皮细胞连接蛋白的功能尚不清楚。本研究重点评价了银杏内酯B对ox-LDL刺激的内皮细胞JAM-A、Cx43表达的影响以及分子机制，并通过白细胞迁移实验分析银杏内酯B对血管渗透性的影响，从而揭示银杏内酯B减轻血管炎症反应的新的药理学作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 银杏内酯B购自江苏大观园商贸公 司，纯 度 为 95% （批 号：BAT2007115）。LY294002、胶原酶、明胶购自Sigma公司；胰蛋白酶、特级胎牛血清购自Hyclone公司，Medium 199培养基购自Gibco（Invitrogen公司）。Transwell小室购自Corning公司。β-actin抗体购自 Santa Cruz公司；JAM-A抗体购自Epitomics公司；Cx43购自Cell Signaling公司。辣根酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG以及FITC标记山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。

1．2 ox-LDL的制备 取新鲜人血清，用梯度超速离心法分离低密度脂蛋白。用5μmol·L－1硫酸铜氧化低密度脂蛋白，37℃、16 h后，加1 mmol·L－1EDTA终止氧化。用PBS（pH 7.3）4℃透析24 h，用0.22μm的Millex滤器过滤，4℃储存备用。

1.3 人脐静脉内皮细胞的分离与培养 取新鲜脐带，用0.1%的Ⅰ型胶原酶灌注消化15 min，收集脐静脉血管内皮细胞，1 000 r·min－1，离心 6 min，用M199培养基（20%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1链霉素和1%谷氨酰胺）悬浮细胞，接种于培养皿中，37℃、5%CO2孵箱中培养。细胞传至第3代用于实验。

1．4 W estern blot方法检测蛋白表达 实验前饥饿细胞12 h，分别用银杏内酯 B（0.2、0.4、0.6 g·L－1）及 LY294002（1、3、10μmol·L－1）孵育 1 h，加入 ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激细胞 4 h。去除培养基，用PBS洗两遍，去除上清，用细胞裂解液RIPA裂解细胞，收集蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。取15μg蛋白样品，经SDS-PAGE后，湿转法转至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白室温下封闭1 h。分别加入特异性抗体（JAM-A、Cx43、β-actin），4℃孵育过夜。用 TBS-T（100 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，0.1%Tween）洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室温孵育1 h。TBS-T洗膜3次，每次5 min。加ECL发光液，用凝胶成像仪成像。

1．5 免疫荧光检测JAM-A、Cx43在内皮细胞的表达 无菌盖玻片置于6孔板中，接种细胞。待细胞融合，用含0.5%胎牛血清的M199培养基饥饿细胞12 h，银杏内酯B孵育细胞1h，ox-LDL刺激细胞4 h。去除培养基，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛室温下固定细胞10 min。然后，PBS洗3次，每次5 min。用5%牛血清白蛋白封闭1 h，一抗（1∶100）孵育，4℃过夜。PBS洗3次，每次5 min，加FITC标记的二抗（1∶100），室温下避光孵育1 h。PBS洗3次，加 DAPI（1∶1 000）染核5 min，洗3次。用50%甘油封片，荧光显微镜下观察荧光强度，用尼康CCD成像系统成像。实验重复至少3次。

1.6 白细胞迁移实验 用collagen包被Transwell小室滤膜外表面，超净台内紫外照射3 h，充分干燥。分别在Transwell小室内加入100μl、小室外加入600μl细胞培养基，于细胞培养箱中平衡1 h。去除小室内的培养基，接种100μl细胞悬液（1×109·L－1），培养72 h，实验前饥饿细胞 12 h。用银杏内酯B孵育细胞1 h，然后用ox-LDL刺激细胞4 h，加入 U937单核细胞株（1×109·L－1），共培养 24 h。在PBS中浸泡小室后用4%多聚甲醛固定10 min，用0.5%结晶紫染色标识单核细胞30min，PBS洗3次，用PBS浸湿的棉签轻轻擦拭，去除小室内侧的内皮细胞。取下滤膜，置于载玻片上。显微镜下随机取5个视野，计数单核细胞，用CCD成像。实验重复至少3次。

1.7 统计学方法 蛋白表达的灰度分析数据以¯x±s表示，采用单因素方差分析studentt检验。

2 结果

2．1 银杏内酯 B对 ox-LDL刺激的内皮细胞JAM-A表达的影响 JAM-A存在于内皮细胞紧密连接处，JAM-A的过表达能够促进白细胞向血管内膜下迁移。结果显示，ox-LDL刺激内皮细胞4 h后，JAM-A表达增加了22%，与对照组比较有明显差异（P＜0.05）。银杏内酯 B（0.4、0.6 g·L－1）明显抑制了ox-LDL刺激的内皮细胞JAM-A的表达（P＜0.05）（Fig 1）。我们用免疫荧光法进一步观察了JAM-A在内皮细胞中的分布。结果显示，ox-LDL刺激细胞后，JAM-A在胞质及胞膜上表达均明显增多，0.6 g·L－1银杏内酯B处理的细胞JAM-A表达基本恢复到正常水平（Fig 2）。

Fig 1 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：JAM-A expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of JAM-A expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

Fig 2 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of JAM-A in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECsnuclearwith DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of JAM-A with the blue-nuclear staining（×400）.

2．2 银杏内酯B对ox-LDL刺激的内皮细胞Cx43表达的影响 Cx43是细胞膜上介导炎症细胞／蛋白通过的缝隙连接蛋白。结果显示，ox-LDL刺激内皮细胞，Cx43表达增加了24%（P＜0.05）。银杏内酯B以剂量依赖的方式抑制了Cx43表达，0.4 g·L－1和0.6 g·L－1浓度的银杏内酯B减少了Cx43的表达（P＜0.05）（Fig 3）。同样，我们用免疫荧光方法进一步证实，ox-LDL刺激后Cx43在细胞膜上表达明显增多，而0.6 g·L－1银杏内酯B处理后，Cx43在膜上的表达减少到基础水平（Fig 4）。

2．3 LY294002对ox-LDL刺激内皮细胞JAM-A、Cx43表达的影响 最近，我们报道了银杏内酯B能够抑制Akt磷酸化，减少内皮细胞炎症反应。LY294002是PI3K特异性抑制剂，首先我们确认了其能够抑制内皮细胞的Akt磷酸化（Fig 5，A、B），进一步探讨了Akt活化是否影响JAM-A、Cx43的表达。结果显示，LY294002（10μmol·L－1）明显抑制了ox-LDL刺激的JAM-A、Cx43表达（P＜0.05）（Fig 5，C、D、E、F）。这一结果提示，银杏内酯 B抑制ox-LDL刺激的内皮细胞JAM-A、Cx43的表达可能与抑制Akt信号通路相关。

Fig 3 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Cx43 expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of Cx43 expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

Fig 4 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of Cx43 in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECs nuclear with DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of Cx43 with the blue-nuclear staining（×400）.

Fig 5 Effect of LY294002 on JAM-A and Cx43 expressions in ox-LDL-treated HUVECsA，C，E：Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressionswere detected by Western blot.B，D，F：Densitometry analysis of Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressions.Data are representativesof four independentexperiments.＃P＜0.05 compared with cellswithoutox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

2．4 银杏内酯B对白细胞迁移的影响 内皮细胞连接蛋白功能损伤能够使炎症蛋白以及炎症细胞向血管内膜下迁移，血管渗透性增加。因此，我们观察了银杏内酯B对减少炎症细胞的浸润／迁移的作用。我们用Transwell实验，观察了银杏内酯B对ox-LDL刺激内皮细胞损伤时单核细胞的迁移情况。结果显示，与未经任何处理的内皮细胞比较，ox-LDL刺激内皮细胞后，单核细胞向Transwell小室外迁移的数量增多。银杏内酯B（0.6 g·L－1）处理的细胞，单核细胞迁移数量明显减少（Fig 6）。表明银杏内酯B能够通过抑制连接蛋白JAM-A、Cx43的表达，减少白细胞迁移，改善血管渗透性。

Fig 6 Effect of ginkgolide B on monocyte transm igration across HUVECsA：Effect of ginkgolide B on monocyte transmigration across HUVECs（×200）；B：Quantitative analysis of U937 transmigration.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

3 讨论

动脉粥样硬化是复杂的慢性血管炎症性疾病，内皮细胞损伤是动脉粥样硬化过程中的早期表现。正常状态下，血管内皮细胞之间通过紧密连接、黏着连接、缝隙连接等构成血管壁屏障，阻止循环中的有害因子向血管内膜下渗透。病理状态下，内皮细胞连接功能受损，血管通透性增强，导致炎症分子以及炎症细胞穿透血管屏障向血管内膜下聚集，促进血管炎症反应。

JAM-A是紧密连接相关蛋白，属于小分子IgG超家族，在内皮细胞、上皮细胞、白细胞、血小板等多种细胞表面均有表达。JAM-A通过与不同配体结合发挥多种功能。内皮细胞表面的JAM-A通过与相邻细胞的JAM-A相互作用构成紧密连接屏障［5］。病理状态下，血小板表面的JAM-A与内皮细胞表面的JAM-A相互作用，介导血小板与内皮细胞黏附。利用siRNA技术沉默人脐静脉内皮细胞的JAM-A基因，血小板黏附于炎症内皮细胞的能力明显减弱［6］。此外，JAM-A还参与白细胞经细胞旁途径渗透到血管内膜下的过程［7-8］，这一过程可能是由内皮细胞表面的JAM-A与白细胞表面的配体LFA-1结合实现的［9］。内皮细胞是血管壁的第一道屏障，病理状态下内皮细胞损伤时，JAM-A介导内皮细胞与血小板黏附、白细胞迁移反应。Cx43是构成缝隙连接的基本单位，缝隙连接通讯结构功能异常在动脉粥样硬化斑块形成中具有重要作用［10］。研究表明，Cx43的过表达可能参与了白细胞向血管内膜下浸润的过程［11-12］。动物实验提示，利用药物或基因疗法降低内皮细胞Cx43的表达能明显抑制动脉粥样硬化的进展［13］。Wei等［14］报告了银杏叶提取物EGb761能抑制内皮细胞Cx43的表达。

银杏内酯B是中药银杏叶的提取物成分之一，为血小板活化因子受体拮抗剂，具有抑制血小板功能、抗动脉粥样硬化的作用［15］。本研究的结果提示，ox-LDL刺激内皮细胞JAM-A、Cx43的表达明显增多，而银杏内酯B能够下调JAM-A、Cx43的表达。PI3K／Akt信号通路与多种炎症反应有关，参与调控单核细胞向血管内膜下迁移浸润［16］。我们先前的研究表明，银杏内酯B能通过抑制PI3K／Akt信号通路的激活，抑制血小板活化，减少血小板及内皮细胞炎症蛋白 PF4、CD40L、ICAM-1等表达［17］。本研究进一步证实，抑制Akt磷酸化同样能够抑制ox-LDL刺激内皮细胞连接蛋白的表达。表明Akt是银杏内酯B药理作用的一个重要靶点。此外，我们通过Transwell实验证实，银杏内酯B减少单核细胞向损伤的内皮细胞下迁移。这些结果表明银杏内酯B能够通过改善内皮细胞连接蛋白功能，改善血管渗透性。

综上所述，银杏内酯B能降低ox-LDL刺激内皮细胞JAM-A、Cx43表达，改善内皮细胞连接蛋白功能，从而改善血管渗透性。这一药理学效应可能与抑制PI3K／Akt信号通路有关。本研究为银杏内酯B抗动脉粥样硬化的研究提供了新的理论和实验依据，具有重要的科学意义。

参考文献：

［1］ Ross R.Atherosclerosis is an inflammatory disease［J］．Am Heart，1999，138（2）：419－20.

［2］ Cavusoglu E，Kornecki E，Malgorzata S，etal.Association of plasma levels of F11 receptor／junctional adhesionmolecule-A（F11R／JAM-A）with human atherosclerosis［J］.JACC，2007，50（18）：1768－76.

［3］ Blackburn JP，Peters N S，Yeh H I，etal.Upregulation of connexin 43 Gap junctions during early stages of human coronary atherosclerosis［J］.Arterioscl Thromb Vasc Biol，1995，15（8）：1219－28.

［4］ Ma L，Liu X，Zhao Y，et al.Ginkgolide B reduces LOX-1 expression by inhibiting Akt phosphorylation and increasing sirt1 expres-sion in oxidized LDL-stimulated human umbilical vein endothelial cells［J］.PLoSOne，2013，8（9）：e74769.

［5］ Bazzoni G，Martinez-Estrada O M，Mueller F，et al.Homophilic interaction of junctional adhesion molecule［J］.J Biol Chem，2000，275（40）：30970－6.

［6］ Azari B M，Marmur JD，Salifu M O，et al.Transcription and translation of human F11R gene are required for an initial step of atherogenesis induced by inflammatory cytokines［J］.J Translat Med，2011，9（1）：98－111.

［7］ Woodfin A，Voisin M B，Imhof B A，et al.Endothelial cell activation leads to neutrophil transmigration as supported by the sequential roles of ICAM-2，JAM-A and PECAM-1［J］.Blood，2009，133（24）：6246－57.

［8］ Woodfin A，Reichel C A，Khandoga A，et al.JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific mannerin vivo：evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration［J］.Blood，2007，110（6）：1848－56.

［9］ Ostermann G，Fraemohs L，Baltus T，et al.Involvement of JAM-A in mononuclear cell recruitment on inflamed or atherosclerotic endothelium inhibition by soluble JAM-A［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25（4）：729－35.

［10］Kwak B，Veillard N，PelliG，et al.Reduced connexin43 expression inhibitsatherosclerotic lesion formation in low-density lipoprotein receptor-deficientmice［J］.Circulation，2003，107（7）：1033－9.

［11］Li Z，Lin X，Gong P，et al.Effects of Gingko biloba extract on gap junction changes induced by reperfusion／reoxygenation after ischemia／hypoxia in rat brain［J］.Am JChin Med，2005，33（6）：923－34.

［12］Veliz L P，Gonzalez FG，Duling B R，et al.Functional role of gap junctions in cytokine-induced leukocyte adhesion to endotheliumin vivo［J］.Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2008，295（3）：H1056－H66.

［13］Ruan L，CaiW，Chen J，et al.Effects of Losartan on expression of connexins at the early stage of atherosclerosis in rabbits［J］.Int J Med Sciences，2010，7（2）：82－9.

［14］Wei J，Wang X，Gong H，et al.Ginkgo suppresses atherosclerosis through downregulating the expression of connexin 43 in rabbits［J］.Arch Med Sci，2013，9（2）：340－6.

［15］闫 琰，赵革新，陈北冬，等.银杏内酯B抑制血小板CD40 ligand表达的分子机制研究［J］.中国药理学通报，2012，28（2）：245－9.

［15］Yan Y，Zhao G X，Chen BD，etal.Inhibitory effectof ginkgolide B on CD40 ligand expression in collagen-induced platelet activation［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：245－9.

［16］Konstantinidis D，Paletas K，Koliakos G，et al.Signaling components invovled in leptin-induced amplification of the atherosclerosis-related properties of human monocytes［J］.JVasc Res，2009，46（3）：199－208.

［17］Liu X，Zhao G，Yan Y，et al.Ginkgolide B reduces atherogenesis and vascular inflammation in ApoE－／－mice［J］.PLoS One，2012，7（5）：e36237.